不同乳桿菌強化發酵紅薯葉及其酸菜品質的研究

宋文華 何 佳 袁江月 芮 蓬 劉錫銘

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 洛陽市微生物發酵工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

紅薯葉有促進新陳代謝、抗氧化、抗腫瘤、抑制病菌等保健功能，氨基酸模式與聯合國糧食及農業組織推薦的基本一致[1]。目前有關紅薯葉功能性成分分析的研究報道較多，如傅莉等[2]研究發現，紅薯葉黃酮能提高2型糖尿病大鼠的免疫能力；徐龍權等[3]研究發現，紅薯葉多糖對細菌的抑制能力大于苯甲酸鈉；吳憶微等[4]表明，紅薯葉功效成分能抑制腫瘤細胞生長。中國紅薯葉產量大，卻因其儲存性差，易腐爛，目前主要以鮮食為主，僅有紅薯葉粗糧饅頭[5]、保健飲料[6]、保健醋[7]等少數幾種產品，難以滿足市場需求，紅薯葉深加工技術和工業化生產已成為眾多研究者關注的熱點。

酸菜是中國傳統的發酵制品，在微生物作用及一系列生化反應下，呈現特有的口感和風味，貨架期較長[8]。目前已有胡蘿卜、甘藍、白菜等30多種風味酸菜[9]，但是有關紅薯葉酸菜的研究鮮有報道。傳統發酵酸菜由于大量雜菌生長繁殖，常常存在亞硝酸鹽含量高、發酵時間長及品質不穩定等突出問題[10]。而眾多研究表明，接種發酵方式能夠解決上述難題，吳映明等[11]研究發現，接種乳酸菌發酵泡菜能明顯降低亞硝酸鹽含量；崔松林等[12]研究發現，接種嗜酸乳桿菌發酵白菜能縮短發酵周期，提高產品安全性。但是有關乳酸菌發酵紅薯葉及其酸菜品質的研究鮮有報道。試驗擬以紅薯葉為原料，基于傳統發酵酸菜，接種不同乳酸菌進行強化發酵，以期為紅薯葉的再利用和規模化加工提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅薯葉：河南科技大學農學院紅薯實驗田；

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，HZLp-005)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，HZLr-023)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，HZLa-008)：實驗室保藏；

食用鹽：河南洛陽大張實業超市；

果葡糖漿：F55，商丘市飲之健生物科技有限公司；

硝酸鉀：基準試劑，天津市科密歐化學試劑有限公司；

亞硝酸鈉：基準試劑，上海市化學試劑一廠；

陽離子交換樹脂：732型，天津四科密歐化學試劑有限公司；

42種游離氨基酸標樣：德國曼默博爾公司；

MRS培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；

3,5-二硝基水楊酸：化學純，上海強順化學試劑有限公司；

N-1-萘乙二胺鹽酸鹽：分析純，天津市光伏精細化工研究所；

無水乙醇、亞鐵氰化鉀：分析純，天津市德恩化學試劑有限公司；

乙酸鋅：分析純，天津市博迪化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電熱恒溫水浴鍋：HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司；

生化培養箱：SPX-250型，北京市永光明醫療儀器公司；

高速冷凍離心機：TGL-16M型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；

分光光度計：UV-2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

食品物性分析儀：TA.XT Epress Enhanced型，英國SMS公司；

超聲清洗儀：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE 52-86A型，上海亞榮生化儀器廠；

全自動氨基酸全自動分析儀：A300型，德國曼默博爾公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與擴培 將前期試驗確定的3種乳酸菌分別置于MRS液體培養基中活化，37 ℃靜止培養18 h，將活化好的菌懸液分別按1∶10擴大培養18 h。

1.2.2 紅薯葉酸菜的發酵 紅薯葉清洗、入壇，以壇內總體積計，植物乳桿菌組、嗜酸乳桿菌組、鼠李糖乳桿菌組、混合乳酸菌組(植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=2∶3∶2)4個乳酸菌強化發酵處理組分別加入2%乳酸菌菌懸液、0.8%果葡糖漿和2%食鹽，以只加2%食鹽為自然發酵對照組。加水至滿壇，密封，25 ℃發酵10 d。

1.2.3 食鹽的添加量 前期試驗中，在相同食鹽濃度下4個處理組發酵終點時的酸菜pH值差異不顯著，但混合乳酸菌組乳酸含量較高。故以混合乳酸菌為發酵菌種，考察發酵過程中食鹽量對乳酸菌發酵紅薯葉酸菜的影響。試驗具體步驟：在裝有待發酵紅薯葉的菜壇中加入2%的混合乳酸菌菌懸液和0.8%的果葡糖漿，設3個食鹽添加組，添加量分別為2%，4%，8%，25 ℃強化發酵5 d。

1.2.4 乳酸含量的測定 酸堿滴定法。

1.2.5 亞硝酸鹽的測定 鹽酸萘乙二胺法[13]，標準曲線方程為y=0.738 8x-0.001 4，相關系數R2=0.999 2。

1.2.6 硝酸鹽的測定 雙波長紫外分光光度法[14]，標準曲線方程為y=0.238 1x-0.007 8，相關系數R2=0.999 6。

1.2.7 可溶性多糖含量的測定 3，5-二硝基水楊酸法[15]，葡萄糖標準曲線方程為y=0.930 2x-0.049 3，相關系數R2=0.995 5。

1.2.8 剪切測試 參照劉剛等[16]的方法，采用刀片探頭(AMORS型)，測前速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，剪切距離8 mm，觸發力5.0 g，切到樣品斷開，得到紅薯葉被切斷時的硬度、咀嚼性和緊實度等指標。

1.2.9 游離氨基酸的提取 強酸型陽離子樹脂交換法[17]。取1.00 g紅薯葉粉末置于錐形瓶，加蒸餾水50 mL，超聲1 h，取出后加亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，70 ℃ 水浴15 min，降溫過濾得粗提液，將粗提液濃縮后緩慢流入處理好的樹脂柱，先用蒸餾水沖洗后用80%乙醇沖洗，再用蒸餾水沖洗，最后用4 mol/L氨水洗脫，收集洗脫液，65 ℃旋轉蒸發，濃縮洗脫液至一定體積，收集樣液備用。

1.2.10 游離氨基酸含量的測量 高效陽離子交換色譜(HPCEC)—柱后茚三酮衍生化法[18]。進樣量20 μL，柱溫40 ℃，反應器溫度70 ℃，茚三酮溶液流速180 μL/min。

2 結果與分析

2.1 食鹽量對乳酸菌強化發酵酸菜pH的影響

為確保發酵順利進行，中國傳統酸菜的食鹽添加量較高，為2%～10%[19]，大量添加食鹽雖可抑制雜菌污染，但大大減緩發酵進程，同時食鹽量過高對健康不利。從圖1可看出，食鹽含量越低，pH下降越快，越早降至最低pH值。食鹽量2%的酸菜pH下降速率更快，pH值始終低于食鹽量4%和8%。原因是較高的食鹽量抑制乳酸菌活性，影響乳酸生成，而pH值是判斷發酵程度的重要指標之一，pH快速降低對防止雜菌污染至關重要。因此，考慮乳酸菌迅速產酸和低鹽飲食理念，以及酸菜的品質，選擇食鹽量為2%進行后續研究。

圖1 食鹽含量對酸菜pH影響

2.2 不同乳酸菌強化發酵對酸菜pH和乳酸含量的影響

據報道，酸菜成熟pH在3.0～4.0[20]，其乳酸含量為6～8 g/kg時口感最佳[21]。從圖2可看出，乳酸菌強化發酵酸菜pH下降速率比自然發酵要快，第1天pH值降至3.1～3.5，第10天pH值基本穩定在3.05～3.22，混菌發酵pH下降最快，最先接近發酵終點，而自然發酵pH第4天才降到3.5，第10天pH為3.35。從圖3可看出，乳酸菌強化發酵產酸快，乳酸含量高于自然發酵。第10天，混菌發酵乳酸含量為6.19 mg/g，單菌發酵在5.25～5.40 mg/g，而自然發酵乳酸含量為4.75 mg/g。由此判斷，第10天時混菌發酵紅薯葉酸菜成熟，而單菌發酵和自然發酵均未成熟。可能原因是植物乳桿菌產酸能力強，在短時間內成為優勢菌種，整個發酵過程占主導地位[22]，嗜酸乳桿菌產酸快，并且耐酸能力強，鼠李糖乳桿菌發酵初期產酸慢，但其耐酸能力強，在發酵中后期產酸量大，而自然發酵存在大量雜菌，乳酸菌含量少且產酸能力弱。試驗結果與黃慧福等[23]研究富源酸菜的結果相似。以上結果表明，乳酸菌強化發酵過程中發酵啟動快，乳酸增加快，pH下降迅速，混菌發酵可以縮短時間，提高酸菜的安全性。

2.3 不同乳酸菌強化發酵對亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽是酸菜發酵過程中常見產物，是亞硝胺合成的前體物，而接種乳酸菌能夠減少亞硝酸鹽產生。從圖4可看出，在第18 h，植物乳桿菌組、嗜酸乳桿菌組、鼠李糖乳桿菌組和混菌組出現“亞硝峰”，峰值分別為16.98，12.87，16.86，11.85 μg/mL，均低于食品安全標準(20 mg/kg)。而自然組“亞硝峰”出現較晚，且峰值是強化發酵的6～14倍。在第120 h，強化發酵亞硝酸鹽含量在0.29～0.45 μg/mL，低于綠色腌制食品亞硝酸鹽含量(4 mg/kg)。從圖5可看出，在第18 h，強化發酵酸菜中硝酸鹽有短暫回升，然后快速下降并趨于平緩，而自然發酵持續下降并趨于平緩。可能原因是發酵初期大量雜菌活性較高，使硝酸鹽逐漸被還原，而乳酸菌不含細胞色素氧化酶系統，不能使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽[24]，且其快速產酸能有效抑制還原菌生長。因此，整個發酵過程，強化發酵硝酸鹽含量高于自然發酵，而混菌發酵硝酸鹽變化與單菌發酵無明顯差異。

圖2 不同乳酸菌對酸菜pH影響

圖3 不同乳酸菌對乳酸含量的影響

圖4 不同乳酸菌對酸菜中亞硝酸鹽含量的影響

圖5 不同乳酸菌對酸菜中硝酸鹽含量的影響

張志國等[25]研究香椿泡菜發現，植物乳桿菌對亞硝酸鹽起到阻斷作用，能夠降低發酵過程的“亞硝峰”，與試驗研究相似；Park等[26]研究發現乳酸菌在各泡菜類型降解亞硝酸鹽發揮重要作用。Yan等[27]研究表明，乳酸菌能使泡菜中硝酸鹽還原菌明顯減少，并確定陰溝腸桿菌是主要硝酸鹽還原菌。以上結果表明，乳酸菌強化發酵能將亞硝酸鹽控制到最低，混菌發酵對亞硝酸鹽的抑制強于單菌發酵(P<0.05)，能保障紅薯葉酸菜食用安全。

2.4 不同乳酸菌強化發酵對紅薯葉多糖的影響

紅薯葉中多糖含量高于其他蔬菜，是天然保健產物。從圖6看出，隨著發酵進行，單菌發酵紅薯葉多糖含量先迅速減少后緩慢回升至平緩，混菌發酵緩慢下降至平緩，而自然發酵先迅速增加至最高，后快速下降至最低，接著緩慢上升至平穩。第10天，各組多糖含量均保持穩定，分別為植物乳桿菌組25.15 mg/g、嗜酸乳桿菌組27.61 mg/g、鼠李糖乳桿菌組26.88 mg/g，混菌組22.90 mg/g和自然組15.62 mg/g。乳酸菌強化發酵多糖含量差異不顯著，但都明顯高于自然發酵，且差異顯著(P<0.05)。可能是自然發酵中微生物分泌的酶類部分分解纖維素，其在初期對糖的利用速率較低[28]，隨著乳酸大量增加，酶的產生及活性受到抑制，纖維素分解過程被阻斷。而乳酸菌不具備分解纖維素的酶系統，不會破壞植物細胞組織，因此，乳酸菌強化發酵多糖含量不會上升。以上結果表明，乳酸菌強化發酵形成的酸性環境阻遏了雜菌對多糖的分解利用，較之自然發酵，降低了多糖的損失率。

圖6 不同乳酸菌對紅薯葉多糖的影響

2.5 不同乳酸菌強化發酵對游離氨基酸的影響

氨基酸的種類越多其功能越齊全。從表1可看出，無論強化發酵還是自然發酵均能增加產品中氨基酸含量。混菌組有24種氨基酸，比自然組多4種，比鼠李糖乳桿菌組多3種，僅在混菌組和鼠李糖乳桿菌組檢測到所有必需氨基酸，且混菌組的必需氨基酸含量(1 561.72 μg/g)高于鼠李糖乳桿菌組(1 544.58 μg/g)，占其氨基酸總量的31.82%，其中含量最高的是亮氨酸(505.53 μg/g)，其次是纈氨酸(466.12 μg/g)，含量最少的是賴氨酸(13.72 μg/g)。Kim等[29]研究發現，γ-氨基丁酸具有降血壓和抗抑郁等多種生理活性，混菌組γ-氨基丁酸含量(278.23 μg/g)高于各單菌組。谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸是酸菜中常見的呈鮮味物質[30]，混菌組谷氨酸和甘氨酸含量最多，分別為596.94，361.70 μg/g，占氨基酸總量的12.21%，7.40%，僅天冬氨酸含量略低(332.79 μg/g)。

以上結果表明，乳酸菌強化發酵對紅薯葉中游離氨基酸總量和種類有顯著影響(P<0.05)，混菌發酵氨基酸種類更均衡，更符合飲食健康標準。

2.6 不同乳酸菌強化發酵對酸菜質構的影響

從圖7可看出，混菌發酵紅薯葉硬度呈先增加后平穩的趨勢，單菌發酵增加后又減少，而自然發酵波動較大，發酵終點，混菌組硬度為685.94 g，大于其他4組；從圖8可看出，5組紅薯葉咀嚼性快速增加并趨于穩定，發酵終點，混菌組咀嚼性為3 178 g·s，各單菌組咀嚼性在3 020～3 061 g·s，而自然組最低(2 940 g·s)；從圖9可看出，各組紅薯葉緊實度不同程度的降低，發酵終點，混菌組紅薯葉緊實度為169.78 g·s，各單菌組在135.06～162.43 g·s，而自然組最低(124.52 g·s)。發酵過程中，紅薯葉緊實度變化趨勢與硬度和咀嚼性變化趨勢不同，可能原因是紅薯葉細胞間層原果膠被水解，喪失粘連細胞的作用，導致緊實度降低，而細胞膨壓減小后又恢復[31]，且纖維素未被分解，使剪切硬度和咀嚼性增加。以上結果表明，乳酸菌強化發酵能夠改變紅薯葉組織狀態，使紅薯葉柔軟有韌性，混菌發酵對紅薯葉硬度、咀嚼性和緊實度等影響明顯大于單菌發酵(P<0.05)。

表1 不同樣品的氨基酸含量比較?

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)；“-”表示低于檢出限；“*”表示必需氨基酸。

圖7 不同乳酸菌對紅薯葉硬度的影響

圖8 不同乳酸菌對紅薯葉咀嚼性的影響

圖9 不同乳酸菌對紅薯葉緊實度的影響

3 結論

(1) 在25 ℃、食鹽量2%條件下，紅薯葉混菌發酵乳酸含量最高(6.19 mg/g)，“亞硝峰”峰值最低(11.85 μg/mL)，發酵終點亞硝酸鹽含量最低(0.29 μg/mL)，多糖含量(22.90 mg/g)與單菌發酵差異不顯著(P<0.05)，發酵時間短，產率高。混菌發酵氨基酸種類最多，其必需氨基酸含量最高(1 561.72 μg/g)，占總氨基酸的31.82%，谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等呈風味氨基酸最豐富。

(2) 乳酸菌強化發酵紅薯葉質地柔軟堅韌，混菌發酵紅薯葉硬度(685.94 g)、咀嚼性(3 178 g·s)和緊實度(169.78 g·s)均最大，可以作為評定紅薯葉質構特性的參考。

(3) 后續試驗需中試發酵和保藏性研究，對混菌發酵紅薯葉進行感官評定、亞硝酸鹽檢測、揮發性成分分析，以及微生物(乳酸菌、酵母菌、霉菌、大腸桿菌等)的動態變化分析，研究出營養豐富，安全健康，口感獨特的紅薯葉酸菜，并與相關企業合作實現產業化應用。