人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

盧曉莉，成樂楠，秦方圓，趙子儀，葛利蔥，翟亞萍，楊秋云

(1.河南大學，河南 開封 475000；2.河南大學人民醫院/河南省人民醫院，河南 鄭州 450003；3.吉林大學，吉林 長春 130023；4.河南省眼科重點實驗室，河南 鄭州 450003)

卵巢癌是女性常見的生殖系統惡性腫瘤，發病率僅次于宮頸癌和子宮體癌，死亡率居婦科腫瘤死亡率的第1位，占女性惡性腫瘤死亡率的5%[1-2]。據統計，2018年有將近30萬新增卵巢癌病例[3]。早期診斷困難，發病時70%～75%患者已處于晚期，5年生存率約為20%[4]。目前對卵巢癌的治療原則仍以手術為主，輔以化療、放療等綜合治療，但效果并不顯著。盡管卵巢癌治療在分子和細胞水平已經取得了實質性的進展，但研究表明，其晚期疾病的長期存活率幾乎沒有提高[5]。卵巢癌的診治仍需進一步研究。因此，為研究人類卵巢癌生物學行為和抗腫瘤實驗性治療，需建立卵巢癌的動物模型。盡管國內外有較多成功建立卵巢癌移植瘤的模型[6-7]，但對小鼠模型建立的具體方法及成瘤情況的相關報道并不多，且各項研究中腫瘤細胞系的選擇，具體接種細胞數量均不同。本研究采用人卵巢癌SKOV3懸浮細胞液皮下注射接種法構建裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，動態觀察記錄裸鼠成瘤情況并探討移植瘤可用于實驗的時機。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器試劑：DMEM/F12培養基(美國Gibco公司)、胰酶(美國Gibco公司)、雙抗青鏈霉素(美國Hyclone公司)、PBS緩沖液(美國Hyclone公司)、血清(美國Gibco公司)；儀器：巴氏管、15 mL離心管、離心機、酒精燈、培養箱、細胞計數板等。

1.2 實驗動物及細胞SKOV3細胞株：購自廣州賽業生物科技有限公司，培養于DMEM/F12完全培養基中(即含10%FBS，1%青鏈霉素的DMEM/F12培養基，5 mL培養基/25 cm2培養瓶)，置于5% CO2、37 ℃、95%飽和濕度培養箱中培養。每48 h換液1次，細胞融合度達80%后進行1∶3傳代。裸鼠：BALB/c Nude鼠，雌性，5～6周齡，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物公司，飼養于河南省中藥研究所，生長所需的墊料、飼料和飲水均經滅菌處理，高效過濾器每小時換氣10～15次，相對濕度保持在45%～60%，每日保持10 h的光照，14 h無光的陰暗周期。

1.3 人卵巢癌移植瘤模型的建立將培養中處于對數生長的SKOV3細胞經2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液洗滌，調整活細胞濃度為2×107個·mL-1，于每只裸鼠背部皮下接種0.2 mL(每只4×106個細胞)。穿刺點距離注射部位1.0 cm，每只裸鼠皮下接種1點，次日記為接種第1天。

1.4 裸鼠生活情況及腫瘤生長情況觀察裸鼠接種腫瘤細胞后繼續于SPF級層流室內飼養，每天觀察其精神、活動、攝食等狀況，是否有腫瘤生長和腫瘤生長速度等。每3 d測量1次荷瘤裸鼠體質量，每3 d用游標卡尺測量腫瘤結節的長徑、短徑，根據公式：體積=1/2×長×寬2，計算結節體積，并做詳細記錄，比較各組間腫瘤大小的差異。觀察結束后，采用二氧化碳安樂死自動儀，將裸鼠安樂死，連同包膜完整剝離出腫瘤組織，對瘤體體質量進行稱量。

1.5 移植瘤病理觀察將完整剝除的移植瘤組織用40 g·L-1的甲醛溶液進行常規固定，制備石蠟包埋切片，制作常規4 μm切片，進行HE染色；常規無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。在光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 裸鼠成瘤情況及腫瘤生長情況接種SKOV3細胞前，實驗組裸鼠的體質量、精神、活動等情況與對照組無明顯差異。實驗組裸鼠體質量為(19.47±0.74)g，對照組裸鼠體質量為(19.53±0.64)g，兩組裸鼠體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。實驗組中有1只裸鼠在觀察期內未發現明顯的移植瘤體出現，余14只裸鼠接種第3～7天在裸鼠接種部位可見或可觸及皮下結節質硬，成瘤率為93.33%。整個觀察期內，實驗組裸鼠的體質量、精神、活動等情況與對照組對比，差異無統計學意義。觀察期間未見瘤體表面皮膚破潰，直至42 d觀察結束當天發現2例瘤體表面皮膚破潰。整個觀察期間，瘤體體積隨時間逐漸增大，接種30 d時可見腫瘤體積明顯增大。見表1。整個觀察期處死裸鼠后完整剝離瘤體，測得腫瘤質量(0.88±0.19)g。

表1 不同時間瘤體體積

2.2 裸鼠移植瘤大體觀察及病理形態觀察大體觀察移植瘤呈圓形或橢圓形，表面未破潰的移植瘤與周圍組織輕度粘連，容易剝離。但出現破潰的2個移植瘤與瘤體皮膚粘連密切，剝離較困難。腫塊質地中等，將瘤體切開，剖面呈魚肉狀，有分葉，色灰白，有4例體積較大的移植瘤中央區域可見壞死液化。HE染色后光學顯微鏡觀察可見腫瘤細胞豐富，排列密集，細胞異型性明顯，核大深染，細胞核質比例明顯增大，畸形核和核分裂相多見。細胞內可見大量空泡，少數細胞核固縮，裂解，偶見凋亡細胞。腫瘤組織內有較多壞死組織和炎癥細胞浸潤，纖維化形成明顯。見圖1。

圖1 裸鼠移植瘤組織HE染色(×200)

3 討論

裸鼠腫瘤模型作為人類研究腫瘤生物學特性以及臨床治療的實驗模型，其可以保留原發腫瘤本身的形態特征及遺傳性[8]。卵巢癌動物模型是探索人卵巢癌生物學特征、治療方法或評估療效的重要研究工具。目前，卵巢癌動物模型的制備主要包括誘發性腫瘤模型和移植性腫瘤模型。移植性腫瘤模型的建立大多采用皮下注射法[9]和腹腔注射法[10-11]。岳靜等[12]比較了人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤、腹水瘤和原位移植瘤模型，認為3種模型從不同方面體現了人卵巢癌的生物學特點，成瘤率分別為100%、100%、90%；雖然人卵巢癌原位模型較皮下移植瘤更客觀地反映了腫瘤的生物學特征，但操作困難，耗時，難度大，成瘤率低。本研究采用了卵巢癌SKOV3細胞懸液皮下注射接種法，操作簡單方便，接種部位在裸鼠右側肩胛背部，易于觀察和測量，同時能避免裸鼠撓抓。

本研究中有1只裸鼠移植失敗，可能是因為一次性接種15只裸鼠，處理好的腫瘤細胞不能及時接種至裸鼠體內或接種時腫瘤細胞分布不均所致。在整個觀察期荷瘤小鼠的體質量與對照組無明顯差異，但如果去除瘤體體質量，荷瘤裸鼠的體質量相對對照組較低。本研究結果顯示，在接種第30天，腫瘤體積明顯增大，且30 d后腫瘤體積增大速度較快。本實驗有2例瘤體表面皮膚出現破潰，在剝離時發現與皮膚粘連致密，很顯然這樣的荷瘤鼠不是進行實驗研究的較好選擇，而且在解剖時發現有些體積較大的瘤體內已經出現液化壞死現象，這可能與瘤體生長過快有關。但30 d前裸鼠的瘤體過小，不宜實驗。因此，進行下一步實驗探究時應選擇體積在100～450 mm3之間較為適宜。

本實驗結果顯示，SKOV3細胞株在裸鼠右側肩胛背部生長良好，所有裸鼠在觀察期內未出現明顯惡病質和意外死亡。如果研究卵巢癌生物學特性或評估藥物療效，在卵巢癌原位移植瘤難以建立時，將SKOV3細胞株接種于裸鼠右側肩胛皮下部位是可行的。移植瘤組織符合人卵巢癌細胞的病理學特征，具有操作簡單，成瘤時間短，成瘤率高，易于觀察等優點，是較為實用的臨床癌動物模型，為后續體內卵巢癌的基礎研究、臨床治療提供了可靠的依據。