柚皮素磷脂復合物對實驗性脈絡膜新生血管NF-κB/iNOS 通路的影響

吉潔，徐新榮，周春剛，唐苗苗，唐穎，王榮榮，王科蕾

脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是較為常見的眼底病變，CNV 的發病因素較為復雜，可能與Bruch’s 膜的損傷、視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞外基質變化、炎癥反應和氧化應激密切相關[1]。目前關于CNV 的形成機制對血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的研究較多[2]。近年來研究表明，核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB)在新生血管形成中具有重要作用，其可調控多種基因的轉錄，包括血管形成因子、黏附因子等細胞因子[3]。誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）與新生血管的形成具有密切的聯系，而iNOS 表達的機制是通過抑制NF-κB 的活化抑制iNOS 的轉錄水平[4]。目前對CNV 的治療主要是糖皮質激素和VEGF 拮抗劑，但這兩類藥物存在高風險和治療費用昂貴等限制，因此尋找治療CNV 的藥物具有重要臨床意義。關于許多中藥單體能明顯抑制眼新生血管生成已有許多相關報道[5]。柚皮素（naringenin，Nar）是二氫黃酮類植物提取物，具有抑制iNOS、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達的作用，但其水溶性差，生物利用率低[6]。故本研究采用柚皮素磷脂復合物（naringin phospholipid complex，NPC）治療CNV 大鼠，探究其對CNV 大鼠NF-κB/iNOS 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 清潔級健康雄性Brown-Norway 大鼠72 只購自北京維通利華動物技術有限公司[SCXK（京）2015-0012]，體重200～220 g，嚴格按照飼養規則喂養大鼠，室內保持通風，溫度25℃，濕度50%，光照時間為12 h（8：00～20:00），大鼠自由飲用蒸餾水，飼養期間保持飼養房間整潔。

1.2 儀器與試劑

柚皮素（北京百靈威科技有限公司）純度＞98%，大豆磷脂（上海浦江磷脂廠），基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）（SIGMA 公司）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）（SIGMA公司）、人單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6（interleukin-6，IL-6)ELISA 試劑盒（美國Abcam 公司），NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF 兔抗鼠一抗（美國R&D 公司）；HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗、β-actin（北京博奧森生物技術有限公司），RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒（Takara 公司）；蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司），RIPA 裂解液、BCA 測定試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；多波長氪激光機（美國Lumenis 醫療激光公司）；X 射線衍射儀（瑞士ARL 公司）；熒光定量PCR 儀（美國BioRed 公司）；光學顯微鏡（德國Carl Zeiss）；凝膠成像儀（購自于美國GE公司）；ImageJ 軟件（USANationalInstitutes of Health）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠SAH 模型制備 大鼠在造模前禁食12 h，腹腔注射10% 水合氯醛（0.3 ml/kg）麻醉動物，用0.5%托吡卡胺與新福林混合散瞳劑充分散瞳孔，采用氪黃激光（波長568 nm，參數：光斑直徑100 μm，曝光時間0.1 s,功率150～200 mW，在120 D 專用前置鏡下，距視盤2～4 個視盤直徑，圍繞視盤在視網膜大血管間光凝8 個點，光凝后待Bruch’s 膜被擊破后產生小氣泡視為合格光凝點，將視網膜、脈絡膜或玻璃體出血大鼠剔除，造模成功大鼠麻醉蘇醒后送回SPF 飼養箱。

1.3.2 藥品制備 柚皮素（Nar）溶于無水乙醇中，加溫至60℃，按照1:2 的質量比加入大豆磷脂攪拌均勻成溶液狀態，過濾溶液，濾液經冷凍干燥機干燥24 h 的柚皮素磷脂復合物（NPC）。

1.3.3 實驗分組及給藥 模型大鼠隨機分為空白對照組12 只，溶媒對照組12 只、Nar 治療組12 只、NPC治療組36 只（分高、中、低三個濃度組），Nar 治療組給藥劑量：20 mg/kg/d，NPC 治療組按高、中、低3 個劑量（10、20、30 mg/kg/d）分別給藥；溶媒對照組給Nar治療組藥液等體積二甲基亞砜（DMSO）。均為腹腔注射。視網膜光凝后當天開始給藥至觀察結束。

1.4 觀察指標

1.4.1 眼底檢查和分析 于大鼠激光治療4 周后行眼底熒光造影（fundus fluorescein angiography，FFA），每組12 只大鼠進行麻醉、散瞳孔，舌下靜脈注射0.3ml的100 g/L 的熒光素鈉進行眼底血管熒光造影檢查，立即開始雙眼攝片，觀察15 min，觀察CNV 形成情況，并計算熒光素滲漏點數占總光凝點數的百分率，評估CNV 的形成率。CNV 的評判標準：光凝點早期低熒光、晚期熒光素滲漏范圍擴大為1 級，光凝點早期強熒光、晚期熒光素滲漏范圍擴大為2 級。

1.4.2 脈絡膜鋪片熒光顯微鏡觀察 給藥治療4 周后，每組取6 只大鼠進行舌下靜脈注射異硫氰酸葡聚糖(FITC-D)（0.2 ml/只），100 mg FITC-D 溶于1 ml的PBS 緩沖液中。灌注完成30 min 后摘除大鼠眼球于4%的多聚甲醛溶液中固定1 h；顯微鏡下沿赤道部打開眼球，去除前節，揭除視網膜神經上皮層，獲得視網膜色素上皮-脈絡膜-鞏膜復合體標本，以視神經為中心做4～6 個放射狀切口，常規梯度進行乙醇脫水、二甲苯透明，隨后將RPE 面向下置于蓋玻片上，封片、烤片。標本置于熒光顯微鏡光鏡下觀察、拍片并使用Image J 軟件進行圖像分析。

1.4.3 RT-qPCR 檢測NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達 參照RNA 提取試劑盒說明書提取眼后節組織（視網膜神經上皮、RPE、脈絡膜復合物）總RNA，組織勻漿快速抽提，測定RNA的濃度和純度；參照反轉錄試劑盒說明書將RNA 反轉錄為cDNA，進行RT-qPCR。RT-qPCR 反應體系：10×cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.5μL，H208μL，2×SYBR Mix 10 μL；RT-qPCR 反應程序為95℃×3min，95℃×10s、60℃×30s，72℃×2 min，40 個循環，72℃延伸10 min。RT-PCR 引物由上海生工生物合成，序列如表1。反應結束后收集數據，以β-actin 作為內參基因，按照2-ΔΔCt算法進行相對定量分析。

1.4.4 Westernblot 檢測NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達 取出超低溫冰箱保存的眼后節組織100 mg，加入1 ml RIPA 裂解液裂解組織，冰上放置30 min，振蕩離心后收集上清液，提取總蛋白；BCA 法測定蛋白濃度，記錄562 nm 處吸光值，繪制標準曲線，計算樣品濃度，變性蛋白；配制濃度為12%分離膠、5%濃縮膠，蛋白上樣量為50 μg，電壓設定在100 V 電泳，電泳完成后蛋白凝膠轉膜至PVDF 膜，用TBST 溶液清洗后5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST 溶液清洗后，加入一抗，4℃過夜，TBST 洗膜3 次/5 min；TBST 清洗后加入二抗，室溫下孵育1 h，洗膜3 次/5 min，TBST 清洗后置于凝膠成像儀中ECL 顯影液顯影，觀察各組蛋白變化情況。以β-Actin 為內參進行灰度值比較。

表1 RT-PCR 引物序列

1.5 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 21.0 進行數據分析。計量資料以平均數±標準差描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用方差分析中LSD-t 檢驗。計數資料采用χ2檢驗。當P＜0.05 時，則認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NPC 對大鼠FFA 檢測結果的影響

健康BN 大鼠視網膜血管呈放射狀行走，光凝后可見明顯瘢痕，空白對照組，溶媒組顯示有強熒光滲漏，熒光素滲透面積分別擴大180 點、175 點，占總光凝數192 點的93.75%、91.14%；Nar 組熒光信號減弱，滲透范圍擴大161 點，占總光凝點數的83.8%，與空白對照組相比CNV 形成率差異有統計學意義（χ2=9.454，P=0.000）；NPC 低、中、高劑量組較空白對照組熒光信號顯著減弱，滲透范圍分別為143 點、120 點、105 點，分別占總光凝數的74.47%、62.5%、54.68%，光凝4 周后CNV 形成率差異均有統計學意義（χ2=26.681、54.857、76.555，均P=0.000）。

2.2 NPC 對大鼠CNV 面積的影響

脈絡膜鋪片熒光顯微鏡觀察造模后視乳頭周圍的光凝點與周圍的脈絡膜比較呈網狀高熒光斑，新生血管形成。由表結合圖片可見，光凝4 周后各組視網膜均可見CNV，表示造模成功。空白對照組、溶媒組新生血管面積最大（圖1A，1B），兩組之間無統計學意義（P＞0.05）。與空白對照組相比，Nar 組和NPC組CNV 面積明顯減少，差異有統計學意義（tnar=15.165，tNPC低=21.411，tNPC中=29.815，tNPC高=34.129，均P=0.000）；NPC 低、中、高三組組間比較總體差異有統計學意義（F=35.117，P=0.000）。高劑量組CNV 面積顯著小于低、中劑量組（tNPC低=8.275，PNPC低=0.000；tNPC中=3.529，PNPC中=0.002）。與Nar 組相比，NPC 低、中、高劑量組CNV 面積明顯減少（tNPC低=8.824，tNPC中=13.920，tNPC高=17.724，均P=0.000）。

圖1 大鼠FFA 檢測結果。1A 空白對照組；1B 溶媒組；1C Nar 組；1D NPC 低劑量組；1E NPC 中劑量組；1F NPC 高劑量組

2.3 NPC 對NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達的影響

與空白對照組相比，溶媒組NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達水平均無統計學意義（均P>0.05）；Nar 組COX-2、MMP-2、MMP-9mRNA表達水平與空白組相比有統計學意義（tcox-2=10.824，tMMP-2=6.346，tMMP-9=14.710；均P=0.000）；NPC 低、中、高劑量三組組間在NF-κB、COX-2、VEGF mRNA 有統計學意義（FNF-κB=95.681，Fcox-2=65.732，FVEGF=86.90，均P=0.000），NPC低劑量組NF-κB、iNOS、COX -2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達水平均較Nar 組降低（tNF-κB=9.824，tiNOS=6.824，tcox-2=9.357，tVEGF=5.824，tMMP-2=5.914，tMMP-9=4.560；均P=0.000），NPC 高劑量組NF-κB、VEGF mRNA 表達水平較低劑量組降低（tNF-κB=35.461，tVEGF=28.175，均P=0.000）。

圖2 大鼠CNV 面積的檢測。2A 空白對照組；2B 溶媒組；2C Nar組；2D NPC 低劑量組；2E NPC 中劑量組；2F NPC 高劑量組

表2 不同藥物處理后大鼠視網膜CNV 面積（×103μm2，n=6）

圖3 大鼠各基因mRNA 檢測結果。3A NF-κB；3B iNOS；3C COX-2；3D VEGF；3E MMP-2；3F MMP-9。1 空白對照組；2 溶媒組；3 Nar 組；4 NPC低劑量組；5 NPC 中劑量組；6 NPC 高劑量組。a 與空白對照組比較，P＜0.05；b 與Nar 組比較，P＜0.05；c與NPC 低劑量比較，P＜0.05

2.4 NPC 對NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達的影響

與空白對照組相比，溶媒組NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平兩組間均無統計學意義（均P>0.05）；Nar 組6 種指標蛋白表達水平與空白組相比有統計學意義（tNF-κB=4.261，tiNOS=4.750，tcox-2=3.824，tVEGF=5.432，tMMP-2=3.376，tMMP-9=10.722；均P=0.000）；柚皮素磷脂復合物組低劑量組iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平與柚皮素組相比有統計學意義（tiNOS=12.117，tcox-2=3.227，tVEGF=5.972，tMMP-2=3.631，tMMP-9=4.932；均P=0.000），柚皮素磷脂復合物高劑量組COX-2、VEGF 蛋白表達水平較中劑量組降低（tcox-2=10.753，tVEGF=6.148，均P=0.000），有統計學意義。

圖4 Western blot 檢測NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達。1 空白對照組；2 溶媒組；3 Nar 組；4 NPC 低劑量組；5 NPC 中劑量組；6 NPC 高劑量組

表3 大鼠NF-κB/iNOS 通路相關因子蛋白檢測結果（±s，n=3）

表3 大鼠NF-κB/iNOS 通路相關因子蛋白檢測結果（±s，n=3）

注：a 與溶媒組比較，P＜0.05；b 與Nar 組比較P＜0.05；c 與NPC 低劑量組比，P＜0.05；d 與NPC 中劑量組比較，P＜0.05

3 討論

柚皮素是廣泛存在于橘子、胡柚皮、檸檬、枳殼中的黃酮類物質，其結構決定了其在水中的溶解度較低，生物利用率低。研究報道天然黃酮類物質與磷脂具有特殊的親和力，可在一定條件下形成復合物，并能增強母體的生物、藥理活性[7-8]。銀杏黃酮磷脂復合物以DMSO 為溶媒可顯著提高銀杏黃酮的溶解度，提高其對動脈粥樣硬化形成的抑制作用[9]。雙氯芬酸與磷脂形成復合物后在正辛烷-水中的分配系數高了約1 倍。淫羊藿黃酮磷脂復合物在正辛烷-水中的分配系數是藥物自身的4 倍，可顯著提高藥物生物利用度[10]。葛根素磷脂復合物的體外透皮滲透實驗中發現葛根素磷脂的復合物的1 h 滲透量顯著高于葛根素[11]。本研究采用腹腔注射柚皮素和柚皮素磷脂復合物改善CNV 大鼠脈絡膜新生血管生成情況，研究結果顯示柚皮素磷脂復合物治療組的CNV 面積和熒光滲透較柚皮素組均顯著降低，表明柚皮素磷脂復合物的生物活性較柚皮素顯著提高，可抑制CNV 的生成。

NF-κB 是生物體內廣泛存在的轉錄因子，其在血管形成中發揮核心調節作用。NF-κB 在視網膜缺氧狀態時表達于視網膜內核層的膠質細胞和內皮細胞核中[12]。年齡相關性黃斑病變和缺血性視網膜病變患者的CNV 均是由缺氧引起[13-15]。NF-κB 在CNV組織的巨噬細胞、血管內皮細胞等視網膜顆粒層組織中表達增加[16]。NO 可促進內皮細胞的增生、遷移，增加血管的通透性，其在體內由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化合成[17]。NOS 中的iNOS 與多種病理過程相關，NF-κB 活性增加可促使iNOS活性升高。iNOS 活性增高可在轉錄水平上誘導VEGF 的表達，調控血管生成[18]。COX-2 是與炎癥反應密切相關的酶，其是VEGF 的上游因子之一，調控眼組織新生血管的形成[19]。敲除小鼠COX-2 基因，可以抑制氪激光誘導的CNV 中VEGF 的表達下調，這可能與MMPs 途徑的活性降低、VEGF-MMPs 系統受到抑制相關[20]。MMPs 在炎性細胞和神經細胞中活性增高或者異常高表達，引起炎性細胞浸潤、血腦屏障損傷等[21]。MMP-2 和MMP-9 參與基質降解、內皮細胞的移行，是CNV 形成、發展必不可少的因素。轉化生長因子-β 多肽抑制物可下調VEGF、COX-2、MMP-2、MMP-9 的表達抑制CNV 形成[22]。

本研究發現，柚皮素及柚皮素磷脂復合物治療組 可 下 調NF-κB、iNOS、VEGF、COX -2、MMP -2、MMP-9 的表達，抑制新生血管的形成、減少CNV 面積和熒光滲透。研究顯示，柚皮素能夠降低NF-κB、COX-2、iNOS 的活性，下調VEGF 的表達，抑制新生血管的形成。推測柚皮素可能是利用其抗炎作用，下調NF-κB、COX-2 的活性，抑制iNOS、VEGF、MMPs 的表達，進而抑制CNV 的形成。而柚皮素磷脂復合物治療組對NF-κB、iNOS、VEGF、COX-2、MMP-2、MMP-9表達的抑制作用優于柚皮素組，柚皮素磷脂復合物治療組CNV 面積和熒光滲透顯著低于柚皮素治療組，提示可能是磷脂復合物改變柚皮素的生物利用度，增強了其對各組酶和細胞因子的抑制作用。

綜上所述，柚皮素磷脂復合物可抑制氪激光誘導的CNV 的形成，其可能通過NF-κB/iNOS 通路發揮作用。但本研究尚存在不足之處，對NF-κB/iNOS通路影響CNV 形成的具體作用機制未詳細探究。今后需將柚皮素磷脂復合物和抗VEGF 藥物進行對照研究，對柚皮素磷脂復合物的抑制脈絡膜新生血管作用會產生更加明確的意義。