生物炭對桃園土壤微生物功能多樣性的影響

劉濤，應建平，張濤，謝樂添

(1.杭州市原種場，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311115)

土壤是農業生產及生態系統的基礎[1]，既是作物生長的重要介質，也是維持作物群體生產力、影響生態環境質量的重要因素[2]。微生物是土壤的重要組成部分，在土壤養分循環、有機質礦化、腐殖質合成和毒物分解等多種土壤生物化學反應中扮演著重要角色[3-4]，與土壤肥力密切相關。微生物對分解土壤有機質、促進腐殖質形成、改善土壤理化性質、增強土壤酶活性及促進植物生長、吸附和轉化有機污染物和重金屬等方面起著重要作用[5-8]。土壤微生物群落功能多樣性是土壤微生物群落狀態與功能的指標，反映了土壤中微生物的生態特征。微生物群落功能為評價微生物多樣性提供了一個可行的、生態相關的測量方法[9]。而BIOLOG代謝多樣性類型與微生物群落組成相關[10]，使其對功能微生物群落變化較為敏感。微生物的生物量自身含有一定數量的碳、氮、磷、硫等，可看成是一個有效養分的儲備庫，對土壤養分具有儲存和調節作用，具有“源與庫”的調控功能[11]。微生物生物量能敏感地反映土壤過程的變化，因為它比土壤有機物周轉更快。

生物炭是生物質在低氧或缺氧條件下通過高溫裂解碳化，形成的高度芳香化、富含碳的多孔顆粒固體[12]。研究表明，在土壤中加入生物炭，不但對增加土壤肥力、均衡土壤有機碳庫有重要意義[13]，還可以延緩作物肥料養分在土壤中的釋放，減少養分的損失，提升肥料養分在作物中的利用率[14]。張秀等[15]研究表明，往鎘污染的土壤中施用生物炭，能提高土壤中微生物群落碳源代謝活性及功能多樣性，效果最好的為2.5%生物質炭處理。武愛蓮等[16]研究發現，施用生物炭會降低褐土中微生物的活性，并且減少或改變褐土中微生物碳源利用的種類，使土壤原有微生物群落組分發生改變。此外，微生物肥料在果樹上的應用研究近年來也取得較大進展。何明莉等[17]在蘋果、桃、葡萄等多種果樹上施入酵素菌豆粕生物有機肥后，樹勢有所增強，產量明顯高于對照，且明顯提升果實品質。施用微生物肥料可提高土壤肥力，改善土壤理化性質。微生物肥料可分解土壤中難溶性磷酸鹽，提高磷肥的利用率。研究認為，磷細菌肥料產生胞外磷酸酶，可催化磷酸酯或磷酸酐等有機磷水解為有效磷[18]。

生物炭肥和微生物肥的單獨應用已有許多研究，但聯合應用的研究較少。本試驗通過土壤中添加生物炭肥和微生物肥試驗，旨在探討其對土壤理化性質和土壤微生物群落結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地設在杭州玉渚農業科技有限公司的水蜜桃果園，水蜜桃品種為夏之夢，樹齡均為8年。本試驗中所采用的生物炭購自溧陽市德勝活性炭廠，所采用的微生物肥購自山東木美土里生物科技有限公司。

1.2 處理設計

試驗共設6個處理。以不施生物炭和微生物肥為對照(CK)；不施生物炭+施微生物肥(BF)；低量生物炭+不施微生物肥(BC1)；低量生物炭+施微生物肥(BC1+BF)；高量生物炭+不施微生物肥(BC2)；高量生物炭+施微生物肥(BC2+BF)。每處理重復3次，每重復15棵樹。具體施用量為：BF處理的微生物肥施量為0.75 kg·m-2；BC1處理的低量生物炭施量為2 kg·m-2；BC2的高量生物炭施量為4 kg·m-2，土地翻耕深度均為35 cm。

1.3 測定方法

采集每個處理桃樹主根周圍50 cm處的土壤，隨機3處取表面20 cm的土壤，同一果樹的土壤取完土壤后立刻混勻，使用冰盒保存，于當日取部分土壤經20目(孔徑0.84 mm)過篩并風干，用于土壤堿解氮、速效磷、速效鉀含量的測定；取部分土壤經100目(孔徑0.149 mm)過篩并風干，用于土壤全氮、有機質含量的測定；取部分土壤經20目過篩，于-20 ℃冰箱保存，用于土壤微生物量、含水量測定，以及Biolog微平板實驗。

1.3.1 土壤理化性質測定

土壤堿解氮含量測定。擴散吸收法。取2.00 g過20目篩的土壤和0.2 g FeSO4放在擴散皿的外室，2 mL硼酸混合指示劑(2.0 g硼酸+20 mL混合指示劑，調pH至4.5定容至1 L，混合指示劑為0.099溴甲酚綠+0.066甲基紅使用100 mL乙醇溶解)放在擴散皿的內室，再在外室加入10 mL的1.0 mol·L-1NaOH水解土壤，水平輕輕旋轉擴散皿，使溶液與土壤充分混勻，用橡皮筋固定，隨后放入40 ℃恒溫箱中，24 h后取出。使用標準酸滴定內室的硼酸混合指示劑，記錄顏色從藍到微紅所消耗的標準酸，然后計算土壤中水解性N的含量。

土壤速效鉀含量測定。50 mL 1 mol·L-1乙酸銨浸提5.0 g過20目篩的土壤，過濾取2 mL濾液加水定容至50 mL，用火焰分光光度計測定。

土壤速效磷含量測定。以0.03 mol·L-1NH4F+0.025 mol·L-1HCl作浸提劑，將5 g過20目篩的土壤溶解于50 mL浸提劑中，過濾后取10 mL濾液加入10 mL 49 g·L-1的硼酸和二硝基酚，用HCl和NaOH調至微黃，加入5 mL鉬銻抗定容至50 mL，用紫外分光光度計測定。

有機質含量測定。0.2 g過100目篩的土壤加入試管中再加5 mL重鉻酸鉀、5 mL硫酸放上彎頸漏洞放入110 ℃的烘箱中90 min，取出后加水倒入三腳瓶中加入鄰菲羅啉使用硫酸亞鐵滴定。

土壤全氮含量測定。凱氏定氮法。取1 g過100目篩的土壤放入消煮管中，加入1.1 g混合指示劑(100 g K2SO4+10 g CuSO4+1 g Se粉研磨)和5 mL硫酸放上彎頸漏斗過夜，然后消煮并用定氮儀測定含氮量。

土壤含水量測定。取10 g左右土壤在120 ℃烘箱烘干測定土壤含水量。

1.3.2 土壤微生物量測定

取15 g鮮土放入燒杯中用氯仿熏蒸24 h，另取15 g鮮土放入不加入盛有氯仿的燒杯的真空干燥器中放置24 h作對照組。熏蒸結束后加入60 mL 0.5 mol·L-1的K2SO4震蕩離心取上清液，稀釋10倍后使用儀器測定。

1.3.3 土壤微生物群落豐富度測定

采用Biolog微平板法測定。稱取相當于10.0 g風干土的新鮮土壤，放至盛有100 mL的0.85%生理鹽水的250 mL三角瓶中，將其在漩渦振蕩器上震動1 min，冰水浴1 min，反復3次，靜置2 min后吸取上清液3 mL放入盛有27 mL 0.85%生理鹽水的離心管中，即得供試土壤接種液，將其接種到Biolog板上后立刻使用酶標儀掃描，然后放在25 ℃恒溫培養箱中陪養，每隔24 h使用酶標儀掃描，試驗持續7 d。

微平板孔中溶液吸光值平均顏色變化率(average well color development，AWCD)計算公式：

AWCD=∑(C-R)/31。

式中，C為所測每個有培養基孔(31個)的吸光值，R為對照空白孔的吸光值。

土壤微生物群落多樣性指數計算公式：

H(Shannon指數)=-∑PilnPi；

D(Simpson指數)=1-∑Pi2；

U(McIntosh指數)=[∑(ni2)]1/2。

式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個微平板所有相對吸光值總和之比。

1.3.4 數據處理

采用Sigmaplot軟件作圖；數據采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，統計分析處理間土壤理化性質、微生物量碳氮、土壤微生物群落豐度之間的差異；多重比較采用Duncan’s法(P=0.05)，平均值在P<0.05水平下的任何差異都具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤理化性質的影響

由圖1可知，除BC1+BF處理的全氮含量顯著高于BF處理外，其他各處理間無顯著差異；除BC1+BF處理的堿解氮含量顯著低于CK外，其他各處理間無顯著差異；除BC1+BF處理的速效磷含量高于CK外，其他各土壤處理均明顯低于CK，且其間無顯著差異；除BC1+BF處理的速效鉀含量顯著高于CK、BC2+BF處理的速效鉀含量顯著高于BF外，其他不同土壤處理間無明顯差異。

柱間無相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2同。

由圖2可知，各不同土壤處理下的土壤含水量與CK處理間并不存在顯著差異。除BC2+BF處理的土壤有機質含量顯著高于CK外，其他處理的土壤有機質含量之間均無顯著差異。

2.2 不同施肥對土壤微生物量的影響

表1顯示的是長期不同施肥處理中土壤微生物量碳(SMBC)、土壤微生物量氮(SMBN)含量測定的結果。由表可知，BF、BC2+BF處理的土壤SMBC值顯著高于對照，除對照外的其他五個處理之間無顯著性差異。BC2、BC2+BF處理的土壤SMBN值顯著低于對照，BF處理高于對照但差異不顯著，BC1、BC1+BF處理低于對照但差異不顯著，BC1+BF、BC2、BC2+BF處理間無顯著性差異。

圖2 不同施肥處理的土壤含水量和有機質含量

表1 不同處理對土壤微生物量碳和氮含量的影響

注：同列無相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表2同。

2.3 不同施肥對群落豐度的影響

AWCD表征微生物群落碳源利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的重要指標，反映了土壤微生物活性和微生物群落生理功能的多樣性。不同處理的AWCD值在第1天變化不大，之后快速上升，第5天后逐漸平靜。其中，BC2的AWCD值明顯低與其他處理(圖3)。

圖3 不同施肥處理下AWCD值隨時間的變化曲線

培養72 h后測定的AWCD數據經標準化處理，并利用相關文獻提供的方法進行主成分分析。根據提取的主成分個數一般要求累計方差貢獻率達到85%的原則，共提取9個主成分，累計貢獻率達88.1%。其中，第1主成分(PC1)的方差貢獻率為33.9%，第2主成分(PC2)為10.1%。第3～9主成分貢獻率均較小，分別為9.7%、7.9%、6.8%、6.4%、5.1%、4.8%、3.4%，故只對前2個主成分進行分析。不同施肥處理在PC軸上出現明顯分異。在PCA1軸上各處理分散分布在正半軸一側，不同處理間存在差異；在PCA2軸上BC2處理分布與其他有較大差異，BC2+BF處理分布在0點附近，其他處理分布較為集中，大多在正半軸一側，且各處理間存在差異(圖4)。整體來看，不同施肥處理存在差異，BC2處理和其他處理差異較大，表現出微生物群落的不穩定性。

圖4 不同施肥處理的主成分分析

AWCD值、Shannon指數、Simpson指數、McIntosh指數分別反映土壤微生物群落對碳源利用的總能力、土壤微生物物種的豐富度、土壤微生物物種的優勢度以及度量群落物種的均勻度。從表2中可得，AWCD值、Shannon指數、Simpson指數的BC2處理低于其他處理，且其他處理間無顯著性差異。McIntosh指數的BC1+BF顯著高于其他處理，其他處理間無顯著性差異。

表2 不同施肥處理微生物群落的AWCD及多樣性指數值

3 討論

生物炭是生物質在低氧或缺氧條件下，通過高溫裂解碳化，形成高度芳香化、富含碳的多孔顆粒固體[12]；而微生物肥中特定的功能微生物通過自身的生命活動，促進土壤中物質的轉化，提高作物營養水平，促進和協助營養吸收，刺激調控作物的生長，防治有害微生物，增加作物產量，提高品質[19]。本研究結果表明，低量生物炭+施微生物肥處理的速效磷含量和速效鉀含量均明顯高于僅施低量生物炭處理，但其堿解氮含量明顯低于低量生物炭處理；高量生物炭+施微生物肥處理下只有土壤有機質含量明顯高于高量生物炭處理，表明施入微生物肥能改善低量生物炭和高量生物炭處理下的速效磷、速效鉀或有機質含量。土壤有機質屬于土壤內的重要組成部分，在土壤肥力、環境保護、農業可持續發展中發揮著重要作用[20]。本研究結果顯示，單獨加入生物炭或微生物肥，不能提高有機質含量，但高量生物炭配施微生物肥則能提高有機質含量。

土壤微生物量的高低反映了土壤同化和礦化能力的大小，是土壤生態系統肥力的重要生物學指標[17]。生物炭對微生物的影響主要是因其多孔和巨大比表面積的結構特性為微生物提供適宜的環境，或者其吸附養分或改良土壤的性質間接影響微生物群。常棟等[21]的研究表明，添加生物炭基肥顯著提高了土壤微生物量。本研究結果顯示，相比對照，低量生物炭、低量生物炭+施微生物肥處理下的SMBC和SMBN含量均無明顯差異；高量生物炭處理下SMBC也無顯著性差異，SMBN含量明顯降低。但高量生物炭+施微生物肥處理則顯著提高SMBC，SMBN含量，但仍低于CK處理。表明高量生物炭處理抑制了土壤中同化氮的微生物，但配施微生物肥可使土壤中利用碳源的微生物明顯增多。

土壤微生物群落功能多樣性是土壤微生物群落狀態與功能的指標，反映土壤中微生物的生態特征。Biolog方法用于環境微生物群落研究具有靈敏度高，分辨力強等特點[22]。在BIOLOG法中，AWCD值、Shannon指數、Simpson指數、McIntosh指數分別反映土壤微生物群落對碳源利用的總能力、土壤微生物物種的豐富度、土壤微生物物種的優勢度以及度量群落物種的均勻度。本研究結果顯示，高量生物炭處理的AWCD值、Shannon指數、Simpson指數均低于CK處理，但高量生物炭+施微生物肥處理下，這些參數均有顯著提高，但與對照間無顯著差異。這表明高量生物炭處理會抑制土壤的微生物，這與彭文龍[23]的研究一致。由于生物炭中含有一些不利于微生物生長的物質，過量的生物炭會對微生物產生毒性。然而，施入微生物肥后能明顯緩減這種抑制作用，這從本研究的主成分分析結果中可以進一步證實。