基于微生物固態發酵的菊花葉資源化利用

竺利紅，張潮，尹小良，施躍峰，李孝輝*

(1.浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所 浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2.浙江豐島股份有限公司，浙江 新昌 312532；3.紹興市越城區東湖鎮農業綜合服務中心，浙江 紹興 312001)

菊花[Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.]是原產于我國的傳統名花，既富有觀賞性，又具藥性。目前，菊花采摘后，其葉多被棄去，易造成嚴重的環境污染和資源浪費[1-3]。菊花葉中含有與菊花類似的活性物質成分，包括揮發油、黃酮、酚酸類、多糖類等，具有抗菌和抗氧化活性，在清除脂自由基方面，其性能還勝于菊花[4-5]。我國是菊花種植和出口大國，據統計，2017年我國菊花種植面積在7 520.5萬hm2左右，每年產生的廢棄菊葉不可估量，如能將其利用起來，經濟效益和社會效益不容小覷。本研究利用益生菌發酵菊花葉，以提高其抑菌活性，延長貯藏周期，旨在為制備菊花葉飼料添加劑提供研究基礎。現總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

發酵菌株：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

檢測菌株：藤黃八疊球菌(Micrococcusluteus)，普通變形桿菌(Proteusvulgaris)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，雞沙門氏菌(Salmonellagullinarum)，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，大腸埃希菌(Escherichiacoli)，醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)，多重耐藥鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiMDRAb)，嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)。

以上菌株均由本實驗室保存。

1.1.2 培養基

常規培養基：乳酸細菌培養基(MRS培養基)，LB培養基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)。

菊花葉培養基：取100 g菊花葉，打漿后加入0.3 g(NH4)2SO4和10 mL水，混勻。

1.2 方法

1.2.1 發酵物制備

取新鮮的植物乳桿菌和釀酒酵母種子液接入菊花葉培養基中，攪拌均勻，密封后置于32 ℃培養箱中培養48 h，得到漿狀發酵物，用于活菌數測定和保存試驗。將漿狀發酵物擠壓得汁液，用于pH值、酸度和抑菌活性測定。

1.2.2 發酵物基本參數測定

活菌數測定。植物乳桿菌計數采用梯度稀釋法。用無菌生理鹽水稀釋發酵物，選取10-6、10-7、10-8這3個稀釋梯度，各吸取0.5 mL與冷卻到40 ℃的MRS培養基混勻，倒平板，于37 ℃條件下培養48 h，選擇單菌落數在30～300的平皿進行計數，根據稀釋倍數計算每克發酵物的植物乳桿菌活菌數。釀酒酵母計數采用血球計數法。

pH值測定。用酸度計測定汁液pH值。

滴定酸度測定。吸取5 mL汁液于100 mL三角瓶中，加入40 mL去CO2蒸餾水，加酚酞2滴，混合均勻后用0.1 mol·L-1NaOH標準溶液滴定至微紅色，且30 s內不褪色。以NaOH溶液消耗體積(mL)除以樣品質量(g)，再乘以1 000，即得酸度(°T)。取3次測定的平均值。

1.2.3 發酵產物抑菌活性測定

將汁液以12 000 r·min-1的速度離心1 min，取上清液過0.22 μm濾膜，取濾液調節至pH值6.5，備用。

抗菌譜測定。采用杯碟法。將檢測菌接種于LB液體培養基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養16 h，將細菌濃度調至107mL-1。取0.1 mL均勻涂在肉湯固體平板上，自然干燥30 min后，將牛津杯(內徑為6 mm)均勻放置在平板上。吸取0.1 mL濾液于牛津杯中，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑。每次測定重復3次，取平均值。對照組在牛津杯中添加空白菊花葉培養基濾液。

對病原菌細胞形態的影響。在30 mL肉湯培養液中按1%的接種量接入雞沙門氏菌種子液(試驗組)，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養8 h，加入濾液1 mL，對照試管中加入無菌水1 mL。60 min后，取對照組和試驗組中的少量菌體于JEM-1400透射電子顯微鏡下觀察菌體內部結構。

1.2.4 保存試驗

將發酵物置于28 ℃ 30 d，進行表觀評價，并以雞沙門氏菌為檢測菌，測定其抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 發酵物基本參數

菊花葉經植物乳桿菌和釀酒酵母混合發酵48 h后，測得1 mL汁液的活菌數分別為16億和2.4億，pH值為3.8，總酸度39.55 °T，說明該菌組合在菊花葉培養基中生長良好。

2.2 抑菌活性

從表1可以看出，菊花葉發酵后，不僅提高了對雞沙門氏菌等幾種病原菌的抑菌活性，同時擴大了抗菌范圍，對普通變形桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌也表現出了較好的抗菌活性。

表1 菊花葉發酵產物的抗菌譜

注：+++++表示抑菌圈直徑在30 mm以上，++++表示抑菌圈直徑在25～30 mm，+++表示抑菌圈直徑在20～25 mm，++表示抑菌圈直徑在15～20 mm，+表示抑菌圈直徑在10～15 mm，—表示抑菌圈直徑<10 mm。

2.3 抑制作用

透射電鏡觀察可知，試驗組的雞沙門氏菌形態結構發生改變，菌體皺縮，破裂，胞內物質外流(圖1中A)；而對照組中菌體成粗桿狀，表面光滑，飽滿(圖1中B)。說明試驗組中的活性物質通過破壞細菌細胞壁膜導致胞內物質外泄，引起細菌死亡。

圖1 菊花葉發酵液對雞沙門氏菌的抑制作用(40 000×)

2.4 保存情況

在28 ℃保存30 d后，發酵液無異味，對雞沙門氏菌的抑菌圈直徑為22 mm，與貯藏前無顯著差異，說明本研究中的菊花發酵液易于常溫保存。

3 小結與討論

新鮮菊花葉不耐貯藏，尤其是當氣溫超過25 ℃時，堆放極易引起腐爛。本研究利用植物乳桿菌和釀酒酵母混合發酵菊花葉，將其貯藏時間延長到30 d以上，同時拓寬了其抗菌譜，提高了其抑菌活性。鮑曼不動桿菌是一種人畜共患菌，在2017年世界衛生組織公布的12大耐藥性細菌排名中，其位居級別1——嚴重耐藥性的第一名。本研究所制備的發酵產物對多重耐藥鮑曼不動桿菌表現出較強的抗菌活性，極具應用潛力。綜上，利用微生物固態發酵菊花葉作為飼料添加劑具有較大的開發前景。