蜂花粉細菌分離及其致病菌耐藥性研究

唐標，代正云，陳怡飛，夏效東，楊華*

(1.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021；2.湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南 永州 425199；3.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

蜂花粉是蜜蜂加工花蜜后加入自身腺上分泌物和唾液制成的團狀物[1]，根據花粉的來源呈現不同的顏色，其中以黃色居多。蜂花蜂是蜂群的主要蛋白質來源，包含蛋白質、氨基酸、碳水化合物、維生素、脂類，酶、輔酶、激素、黃酮、多肽、微量元素等多種生物活性物質[2]。因多酚類和黃酮類物質廣泛存在，蜂花粉被認為是一種有效的抗氧化劑[3-5]。同時，蜂花粉還具有抗動脈粥樣硬化活性[6]，被消費者用作營養和保健品。

新鮮采集的蜂花粉含水量較高，在晾曬、分裝等粗放式加工過程中可能使蜂花粉產品受到微生物的二次污染，從而對人體健康構成潛在風險[7]。一直以來，關于蜂花粉中細菌污染的研究較少[8-9]。一方面是因為蜂花粉具有一定的抗菌活性[10]，細菌含量少，較難分離；另一方面也是由于傳統的細菌鑒定流程繁瑣，導致人們可能會忽視零星檢出的可疑菌落。

本研究收集了浙江省主要蜂花粉產區的代表性蜂花粉樣品，對其進行了細菌分離，隨后通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行快速鑒定，以反映產品中存在的細菌污染狀況，并首次對來源于蜂花粉中的克雷伯氏菌的藥物敏感性進行檢測分析，相關結果可為評估蜂花粉產品的質量安全提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：Bio-Rad Gel Doc凝膠成像系統，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；Eppendorf 5424R微量高速離心機，艾本德中國有限公司；Nanodrop ONE核酸定量儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SW-CJ-ICU超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀，德國布魯克·道爾頓公司。

試劑：LB培養基、EMB培養基、緩沖蛋白胨水(BPW)，購自北京陸橋技術股份有限公司；質控菌株——大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC 25922系本實驗室保藏；MALDI-TOF MS基質——α-氰基-4羥基肉桂酸(HCCA)，購自Sigma公司；2×TaqMaster Mix、DNA marker(相對分子質量標記)，購自TaKaRa公司；細菌基因組DNA提取試劑，購自上海捷瑞生物工程有限公司；96孔肉湯微量稀釋法藥敏板，購自上海星佰生物技術有限公司。

1.2 樣品采集與細菌分離

在浙江省龍游、長興、蘭溪、江山、武義等市縣采集不同類型的蜂花粉樣品107個，詳細信息參見本實驗室先前的報道[7]。稱取1 g蜂花粉樣品在37 ℃通過BPW過夜預增菌，然后同時在LB和EMB培養基上劃線分離，挑選疑似克隆后純化3次，使用20%甘油保藏到-80 ℃冰箱。將分離株劃線于LB平板，37 ℃培養12～24 h復蘇，挑單克隆用于后續研究。

1.3 MALDI-TOF-MS鑒定分析

將純化單菌落均勻涂抹至MALDI靶板上的圓孔內，加入1 μL 70%的甲酸溶液裂解細胞，自然晾干后加入1 μL HCCA基質溶液覆蓋，自然干燥結晶。使用MALDI Biotyper RTC[11]軟件進行樣品指紋圖譜的自動采集和分析。將采集的指紋圖譜與數據庫進行比對，分值越高，則鑒定準確的可信度越高：分值在2.3～3.0的，表示鑒定到種水平，且可信度高；分值在2.0～2.2的，表示鑒定到種水平；分值在1.7～1.9的，表示鑒定到屬水平。

1.4 基因組DNA抽提與擴增

參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ONE進行檢測，保存于-20 ℃冰箱備用。細菌的16S擴增子測序使用通用引物8F(5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′)和1492R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)。

1.5 藥物敏感性檢測

采用肉湯微量稀釋法測定抗菌藥物對試驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)，使用E.coliATCC 25922作為質控菌株，利用上海星佰生物技術有限公司的藥敏檢測板，按照產品說明書進行試驗。測定的抗菌藥物包括氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、四環素、氯霉素、復方新諾明、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、萘啶酸、阿奇霉素、磺胺異噁唑、環丙沙星、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶-克拉維酸、多黏菌素E、多黏菌素B、米諾環素、阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、美羅培南、左氧氟沙星、多西環素、卡那霉素、鏈霉素、吉米沙星。所有MIC數據參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)2015版M100-S25文件解釋。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離鑒定

對107份蜂花粉進行細菌分離，總計分離出38株菌株，大部分蜂花粉樣品通過預增菌后在EMB平板上培養24 h沒有可見菌落。通過MALDI-TOF MS檢測，將分離出的菌群進一步鑒定到種水平。圖1顯示了3個代表性菌株——肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)和黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)通過細菌質譜檢測的結果，其譜圖具有明顯的差異，檢測值也有較高的可信度。對于得分值較低的個別菌株進一步通過16S測序驗證。如表1所示，最終鑒定獲得的細菌分屬于10個屬20個種，包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、埃希菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克羅諾桿菌屬(Cronobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、勒克氏菌屬(Leclercia)、泛菌屬(Pantoea)、腸球菌屬(Enterococcus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，占比較高的為腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬，前者共有10株，其中7株為陰溝腸桿菌；后者共有7株，其中4株為肺炎克雷伯菌。分離出的菌株中，25株為革蘭氏陰性菌，全部屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，其中多數為條件致病菌；13株為革蘭氏陽性菌，包括腸球菌科(Enterococcaceae)和芽孢桿菌科(Bacillaceae)。

2.2 藥物敏感性檢測

克雷伯氏菌屬為常見的致病菌，尤以肺炎克雷伯菌為代表。對分離的克雷伯氏菌屬菌株(分別編號為KP16、KP29-2、KP24、KP31、KO59、KO55、KV3-2)進行藥物敏感性檢測，獲得其對30種藥物的MIC值(表2)。其中，6株菌對氨芐西林具有耐藥性，KO59對頭孢唑林具有耐藥性，KO55對頭孢西丁具有耐藥性。測試菌株對其他的藥物均表現為敏感，較來源于臨床或者動物腸道的肺炎克雷伯菌耐藥性水平較低[12]。

3 小結與討論

本研究從107份蜂花粉中分離出38株細菌，以腸桿菌科細菌為主，分屬于10個屬，其中7株屬克雷伯氏菌屬，藥敏檢測發現其耐藥水平較低，僅個別菌株對頭孢類抗生素耐藥。總的來說，蜂花粉具有一定的食品安全風險。

圖1 代表性菌株肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和黏質沙雷氏菌的質譜鑒定結果

表1 蜂花粉中分離的細菌統計

一直以來，關于蜂花粉的細菌污染研究報道極少。蜂花粉不僅影響蜜蜂腸道微生物組成[13]，同時作為保健品關系食品安全。本研究對浙江省的蜂花粉進行了采樣，對可培養的細菌進行了分離鑒定，獲得了較多的致病性的腸桿菌科細菌，對蜂花粉的細菌污染狀況有了初步的認識，并對其中分離到的克雷伯氏菌屬菌株的耐藥性進行了探究。

表2 供試克雷伯氏菌的MIC值

注：標*的判斷為耐藥。

蜂花粉中的菌群較糞便、土壤、河流樣品簡單[14-15]，但是其攜帶細菌的來源是多樣的，包括蜜蜂腸道、植物花粉、生長環境，以及加工儲運環節[16-18]。據報道，高通量測序發現，克雷伯氏菌屬、泛菌屬、腸桿菌屬和沙雷氏菌屬在蜜蜂腸道中較常見[19]，本研究同樣分離到上述細菌，但是蜂花粉中攜帶的細菌與蜜蜂腸道中上述細菌的因果關系仍不明了，需要進一步研究。

蜂花粉類型較多，屬于小眾農產品，加工和儲運以個體戶為主，所以細菌的污染狀況具有一定的隨機性。蜂花粉通過預增菌后，細菌的分離率仍較低。本研究將MALDI-TOF-MS應用于蜂花粉這一農產品上，通過對可培養的菌落進行鑒定，較容易地鑒定出38株細菌。本研究第一次較系統地分離出蜂花粉產品中的細菌，提高了對蜂花粉細菌或致病菌污染的認識，但是對于全面研究蜂花粉的細菌污染狀況仍有不足。隨著細菌質譜的應用，未來可以更方便地對更多的農產品進行細菌污染研究，這對于提高農產品質量安全水平具有重要價值。