T細胞可誘導共刺激分子配體胞外段基因的克隆與表達

汲 翔，郭 勛，范丹丹，康巧珍，袁維堂

1)鄭州大學第一附屬醫院肛腸外科 鄭州 450052 2)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 3)鄭州大學河南省醫藥科學研究院腫瘤研究所 鄭州 450052

T細胞可誘導共刺激分子(inducible co-stimulator, ICOS)及其配體(ICOS ligand, ICOSL)是近年來發現的B7/CD28家族成員[1]。ICOSL又名B7h、B7-H2，最早在研究鼠cDNA文庫時分離獲得，在正常生理狀態下低水平表達于B細胞表面，通過與T細胞的ICOS相互作用，構成ICOS/ICOSL信號通路，主要調控T細胞的活化、Th1/Th2細胞亞群分化等[2-3]。ICOSL在炎癥性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病中發揮重要的免疫調節作用[4-5]。有研究[6]表明ICOSL在多種腫瘤細胞中高表達，與腫瘤細胞的免疫逃逸密切相關。還有報道[7-8]表明，使用單克隆抗體阻斷ICOS/ICOSL信號通路會下調T細胞表面活化標志物CD69和CD25表達，減少IL-4和IFN-γ細胞因子的產生，抑制小鼠紅斑狼瘡疾病模型的發展。但該信號通路在抗腫瘤免疫和自身免疫疾病中的分子機制還有待深入研究。克隆ICOSL胞外段(ICOSL-N)基因并獲得重組融合蛋白不僅為研究ICOS/ICOSL信號通路在T細胞活化調控中的功能機制提供分子模型，還將為腫瘤免疫治療提供新思路。本研究利用生物信息學軟件設計ICOSL-N和IgG4基因引物，采用RT-PCR法從小鼠脾臟中克隆目的基因ICOSL-N，通過基因工程技術構建原核重組質粒pET22b-ICOSL-N-Ig，獲得ICOSL-N-Ig重組蛋白，為ICOS/ICOSL信號通路機制研究及免疫調節藥物研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料大腸桿菌DH5α、感受態細胞E.coliBL21(DE3)、限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ、RNAiso Plus試劑盒購自大連寶生物公司，Pfu Master Mix試劑購自北京康為世紀生物公司，反轉錄試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司，質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Genview 公司，DNA產物純化試劑盒購自北京索萊寶生物有限公司，pET22b(+)載體購自大連寶生物公司，人源IgG4重鏈Fc基因模板為實驗室保存。

1.2引物設計與合成搜索NCBI中GenBank數據庫和UniProt蛋白數據庫，查詢小鼠ICOSL和人源IgG4編碼基因序列，采用Primer 5軟件設計ICOSL-N和IgG4基因PCR上下游引物序列。利用重疊延伸PCR設計原理和選取的酶切位點，在ICOSL-N的上游引物插入NdeⅠ酶切位點，IgG4基因下游引物插入XhoⅠ酶切位點，同時分別在ICOSL-N下游引物和IgG4上游引物插入柔性鏈接子(GGGS)3。ICOSL-N上游引物：5’-CCGCATATGCTCATCATTGGCTTTGGC-3’；下游引物：5’-AGAACCGCCACCGCCGGAGCCACCGCCACCAGATCCGCCACCGCCCTCATTATTGTGGGTTTCCT-3’。IgG4上游引物：5’-GGCGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGCTGAATCTAAGTACGGTCCA-3’，下游引物：5’-GGGCCCTCGAGACCAAGACTTAATGAAAG-3’。劃線部分為酶切位點，加粗部分為柔性鏈接子(GGGS)3序列。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3PCR模板制備選取8周齡SPF級C57BL/6小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟組織50 mg，按照RNAiso Plus試劑盒說明書操作，提取總RNA，定量取1 μg 總RNA，反轉錄(42 ℃60 min，70 ℃5 min)獲得模板cDNA，-20 ℃保存備用。

1.4ICOSL-N和人源IgG4基因克隆以保存的C57BL/6小鼠脾臟cDNA和人源IgG4基因為模板，采用ICOSL-N和IgG4上下游引物分別進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，29個循環；72 ℃6 min。收集PCR產物，利用DNA 產物純化試劑盒對PCR產物進行純化，4 ℃保存。

1.5ICOSL-N-Ig融合基因的制備采用PCR重疊延伸技術，即在ICOSL-N下游引物和IgG4上游引物擴增過程中，重疊鏈(GGGS)3延伸，目的基因ICOSL-N和IgG4 連接后得到融合基因ICOSL-N-Ig片段。分別取2 μL ICOSL-N和2 μL IgG4的PCR純化產物，加入ICOSL-N上游引物2 μL、IgG4下游引物2 μL、Pfu Master Mix 25 μL、ddH2O 17 μL后進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，29個循環；72 ℃6 min。取5 μL PCR產物，經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電壓120 V，時間30 min，凝膠圖像分析儀觀察記錄實驗結果。

1.6pET22b-ICOSL-N-Ig原核表達質粒的構建按照質粒小提試劑盒說明書提取pET22b(+)空質粒，融合基因片段與pET22b(+)質粒用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，37 ℃反應3 h。回收雙酶切產物，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。常規轉化DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆進行雙酶切與測序鑒定。

1.7融合蛋白的誘導表達與鑒定將測序正確的陽性重組質粒pET22b-ICOSL-N-Ig轉化至原核表達菌株BL21(DE3)，接種環挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養基內，200 r/min、37 ℃過夜振蕩培養。次日以體積比1∶100轉接于新鮮的LB培養基中，200 r/min、37 ℃培養。利用分光光度計檢測600 nm處的光密度(OD)值，當OD值達到0.6(對數生長期)時，加入誘導劑0.4 mmol/L IPTG 37 ℃誘導培養4 h，收集菌液，9 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀物，-20 ℃保存。用可溶性平衡緩沖液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L咪唑、10 mmol/L Tirs，pH 8.0)重懸菌體后超聲破碎，然后離心收集沉淀和上清。以BL21(DE3)和pET22b 空質粒作為陰性對照。SDS上樣緩沖液處理樣品，120 g/L SDS-PAGE電泳分析融合蛋白表達情況。

2 結果

2.1ICOSL-N基因的克隆及與IgG4基因的體外融合PCR分別擴增出ICOSL-N與IgG4基因序列后，利用PCR重疊延伸技術擴增，得到符合理論值1 425 bp的基因條帶(圖1)，表明成功制備融合基因ICOSL-N-Ig。

M：DNA Marker；1：ICOSL-N-Ig；2：ICOSL-N；3：IgG4

2.2pET22b-ICOSL-N-Ig原核表達質粒的鑒定陽性克隆雙酶切鑒定結果(圖2)顯示，目的基因條帶符合理論預期大小(1 425 bp)，與ICOSL-N-Ig片段大小一致，表明成功構建了pET22b-ICOSL-N-Ig原核表達質粒。

M：DNA Marker；1：pET22b-ICOSL-N-Ig雙酶切結果

2.3pET22b-ICOSL-N-Ig測序結果將雙酶切鑒定符合預期的陽性克隆進行測序，將測序結果與NCBI數據庫中小鼠ICOSL-N基因序列進行在線比對，結果與數據庫中ICOSL-N及IgG4基因一致，證實成功構建了ICOSL-N-Ig基因融合表達的重組質粒。

2.4融合蛋白的誘導表達SDS-PAGE結果(圖3)顯示，ICOSL-N-Ig以包涵體形式存在于菌體中，在53 800處可見明顯的條帶，且與目標蛋白的大小基本一致，表明融合蛋白ICOSL-N-Ig成功誘導表達。

M：蛋白Marker；1：BL21(DE3)菌體沉淀物；2：BL21(DE3)菌體上清

圖3重組蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

3 討論

T細胞是獲得性免疫應答的主要識別和效應細胞，其活化調控與機體抗感染、抗腫瘤及自身免疫疾病的發生密切相關。T細胞活化受兩種信號調控：第一信號是由T細胞受體(T cell receptor, TCR)與抗原肽-MHC復合物相互作用啟動；第二信號是ICOS與ICOSL結合形成的輔助信號。ICOS是表達于T細胞表面的一類跨膜糖蛋白，其與ICOSL結合不僅能增強T細胞與抗原遞呈細胞的連接，促進TCR與抗原肽-MHC復合物的結合，還能向T細胞傳遞完全活化所必需的輔助信號，參與T細胞增殖、分化及免疫功能的調控[1]。

目前已經發現的T細胞ICOS/ICOSL有很多種，包括CD28/B7、CD40/CD145、Fas/FasL、OX40/OX40L、4-1BB/4-1BBL[9-11]等。B7家族ICOS是由結構相關的細胞表面蛋白組成，通過與其受體相結合提供共刺激或共抑制信號來調節免疫應答[2]。本研究通過查詢GenBank數據庫和UniProt蛋白數據庫得到了T細胞ICOSL-N基因序列，利用基因工程技術將鼠源ICOSL-N基因與人源IgG4重鏈Fc恒定區蛋白進行融合，成功構建了原核表達質粒pET22b-ICOSL-N-Ig。IgG4的引入為利用融合蛋白ICOSL-N-Ig開展免疫調節功能與機制的體內外研究奠定了基礎。

本研究選用經典的大腸桿菌原核表達系統獲得目的基因融合蛋白。原核表達系統具有操作簡單、成本低廉且易用于產業化推廣等優點，但在蛋白誘導表達過程中易出現包涵體。包涵體的形成受多因素影響，本實驗中誘導表達的ICOSL-N-Ig融合蛋白就是以包涵體形式存在，后續將會繼續開展融合蛋白表達體系的優化及蛋白純化工藝研究。