miR-383-5p與KIF3B的靶向關系及對皮膚鱗狀細胞癌增殖、凋亡的調控

林永麗,李 艷,雷東春,楊 燦

1)駐馬店市中心醫院皮膚科 河南駐馬店 463000 2)鄭州市第三人民醫院腫瘤科 鄭州 450000 3)河南省人民醫院皮膚科 鄭州 450000

皮膚鱗狀細胞癌是常見的一種惡性腫瘤且具有較高的發病率及死亡率，目前臨床主要以手術治療為主，具有一定治療效果，但患者預后較差[1]。皮膚鱗狀細胞癌發病機制尚未闡明，因而探究其發生發展的分子機制有助于改善患者預后。miRNA可通過調控靶基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程，既往研究[2-4]顯示部分miRNA在皮膚鱗狀細胞癌中異常表達并可調控腫瘤細胞增殖及凋亡等過程,在皮膚鱗狀細胞癌發生過程中發揮重要作用[5-6]。miR-383-5p在乳腺癌、宮頸癌中表達下調，抑制miR-383-5p表達可促進腫瘤細胞增殖及侵襲[7-8]。生物信息學分析結果顯示驅動蛋白家族成員3B(kinesin family member 3B，KIF3B)可能是miR-383-5p的靶基因。研究[9]表明KIF3B在大腸癌中高表達并可促進腫瘤進程。本研究首先分析了miR-383-5p與KIF3B在皮膚鱗狀細胞癌細胞系中的表達情況，探究二者之間的靶向關系，探討miR-383-5p與KIF3B對癌細胞增殖及凋亡的影響，以期為揭示皮膚鱗狀細胞癌發病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器DMEM、Opti-MEM減血清培養基購自美國Gibco公司,胎牛血清、lipofectamine2000、胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；RIPA裂解液購自北京全式金生物技術有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。miR-383-5p模擬物(miR-383-5p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、KIF3B小干擾RNA(si-KIF3B)購自廣州銳博生物科技有限公司。pcDNA3.1購自上海遠慕生物科技有限公司。MTT購自美國RD公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司。兔抗人KIF3B抗體購自美國CST公司，抗人細胞周期蛋白1(Cyclin D1)、活化的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)抗體購自美國Santa Cruz公司， HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2細胞來源及培養人正常皮膚細胞株HaCaT,皮膚鱗狀細胞癌細胞SCC13、A431、HSC-5購自美國ATCC細胞庫，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM完全培養基培養，于37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養，待細胞生長融合度達到70%時進行傳代培養。

1.3HaCaT、SCC13、A431和HSC-5細胞中miR-383-5p和KIF3B表達的檢測

1.3.1 miR-383-5p和KIF3B mRNA的檢測 采用qRT-PCR法檢測細胞中miR-383-5p、KIF3B mRNA表達水平。miR-383-5p正向引物5’-AAGGTGATT GTGGCTTTGGG-3’，反向引物5’-ACGACTCA CAGCTAGCTACC-3’。KIF3B正向引物5’-TGAAATCGCCTCCACCTTCT-3’，反向引物5’-CAGGGCAGAAAAGGGAGGTA-3’。U6正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物5’-TGATGTCACGCACGATTTC-3’。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。PCR反應體系：10×Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，用無RNase的ddH2O補足體系至25 μL。反應條件：95 ℃ 60 s；95 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36次循環。miR-383-5p以U6為內參，KIF3B以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達量。

1.3.2 KIF3B蛋白的檢測 采用Western blot法檢測。收集細胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心后提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加一抗稀釋液(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加二抗稀釋液(1∶2 000)室溫條件下孵育1 h，暗室內曝光顯影。應用凝膠成像分析系統及Image J分析條帶灰度值。以目的條帶與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.4SCC13細胞的轉染取對數生長期的SCC13細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，調整細胞密度為1×104個/mL，接種于6孔板(200 μL/孔)，待細胞生長融合度達到70%時更換培養基為Opti-MEM減血清培養基。按照lipofectamine2000說明書分別將miR-NC、miR-383-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-383-5p、si-KIF3B、miR-383-5p mimics+pcDNA-NC、miR-383-5p mimics+pcDNA-KIF3B轉染至SCC13細胞中。轉染6 h后更換為含體積分數10%胎牛血清的DMEM完全培養基繼續培養48 h。收集對數期細胞進行后續研究。

1.5miR-383-5p與KIF3B靶向關系的預測和驗證采用Starbase預測miR-383-5p與KIF3B的靶向關系，并應用雙熒光素酶報告實驗驗證。分別將含有結合位點與突變位點的KIF3B-3’UTR插入熒光素酶報告基因載體，構建載體WT-KIF3B與MUT-KIF3B。利用lipofectamine2000轉染試劑分別將WT-KIF3B或MUT-KIF3B與miR-NC或miR-383-5p mimics共轉染至SCC13細胞，轉染48 h后檢測細胞中熒光素酶活性。

1.6過表達miR-383-5p的SCC13細胞增殖、克隆形成和凋亡能力的變化

1.6.1 實驗分組 收集miR-383-5p組、miR-NC組細胞，qRT-PCR法檢測細胞中miR-383-5p的表達，方法同1.3.1。以未轉染細胞作為空白對照。

1.6.2 細胞增殖率的檢測 取3組細胞接種至96孔板，每組3個復孔，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM完全培養基培養48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光振蕩孵育10 min，應用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。細胞增殖率=實驗組吸光度/空白孔吸光度×100%。實驗重復3次。

1.6.3 平板克隆形成實驗 將3組細胞接種于48孔板(100 μL/孔)，每組3個復孔，培養36 h后收集細胞，PBS洗滌，加入含體積分數10%胎牛血清且不含抗生素的培養液。調整細胞密度為3×104個/mL，接種于12孔板(100個/孔)，置于37 ℃培養箱培養，每3 d更換一次培養液，共培養2周。計數肉眼可見的克隆數。

1.6.4 細胞凋亡率的檢測 收集3組細胞，1 000 r/min離心6 min，預冷PBS洗滌，加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫振蕩孵育10 min，上流式細胞儀檢測，應用Cellauest軟件計算細胞凋亡率。

1.6.5 Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白的檢測 采用Western blot法檢測，方法同前。

1.7抑制KIF3B表達后SCC13細胞增殖、克隆形成和凋亡能力的變化收集未轉染組、si-KIF3B組細胞，Western blot法檢測KIF3B、Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白的表達；按1.6方法檢測細胞增殖率、克隆形成能力和凋亡率。

1.8過表達KIF3B和miR-383-5p后SCC13細胞增殖、克隆形成和凋亡能力的變化收集miR-383-5p+pcDNA-NC組、miR-383-5p+pcDNA-KIF3B組細胞，Western blot法檢測KIF3B、Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白的表達；按1.6方法檢測細胞增殖率、克隆形成能力和凋亡率。

1.9統計學處理采用SPSS21.0分析數據。多組細胞中miR-383-5p和KIF3B表達水平，細胞增殖、克隆形成和凋亡能力，Cyclin D1和Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，或兩獨立樣本的t檢驗；熒光素酶活性的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4種皮膚細胞中miR-383-5p和KIF3B 表達的比較見圖1、表1。與HaCaT細胞相比，SCC13、A431、HSC-5中miR-383-5p表達水平降低，KIF3B mRNA及蛋白表達水平升高(P<0.05)。SCC13細胞中miR-383-5p的表達水平最低，因而選用SCC13進行后續研究。

圖1 4種細胞中KIF3B蛋白的表達

表1 4種細胞中miR-383-5p和KIF3B 表達的比較

*：與HaCaT比較，P<0.05

2.2miR-383-5p與KIF3B靶向關系的驗證Starbase預測結果顯示miR-383-5p與KIF3B存在結合位點，見圖2。雙熒光素酶報告實驗結果(表2)顯示， WT-KIF3B和miR-383-5p共轉染組細胞熒光素酶活性低于WT-KIF3B和miR-NC共轉染組(P<0.05)； MUT-KIF3B和miR-383-5p共轉染組與MUT-KIF3B和miR-NC共轉染組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3過表達miR-383-5p對SCC13細胞增殖、克隆形成能力和凋亡的影響指標檢測結果見表3。與未轉染組和miR-NC組相比，miR-383-5p組細胞增殖率和克隆形成數降低，細胞凋亡率升高，Cyclin D1表達水平降低，Cleaved-Caspase-3表達水平升高(P<0.05)。

圖2 miR-383-5p與KIF3B 結合位點示意圖

表2 雙熒光素酶報告實驗結果(n=9)

表3 未轉染組、miR-NC和miR-383-5p組細胞增殖、克隆形成和凋亡檢測結果(n=9)

*：與空白組和miR-NC組比較，P<0.05

2.4抑制KIF3B對SCC13細胞增殖、克隆形成能力和凋亡的影響指標檢測結果見表4。與未轉染組相比，si-KIF3B組細胞增殖率、克隆形成數降低，細胞凋亡率升高，Cyclin D1蛋白表達水平降低，Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)。

表4 未轉染組、si-KIF3B組細胞增殖、克隆形成和凋亡檢測結果(n=9)

2.5過表達KIF3B和miR-383-5p對SCC13細胞增殖、克隆形成能力和凋亡的影響指標檢測結果見表5。與miR-383-5p+pcDNA-NC組比較，miR-383-5p+pcDNA-KIF3B 細胞增殖率、克隆形成數、Cyclin D1蛋白表達水平增加，細胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平降低(P<0.05)。

表5 miR-383-5p+pcDNA-NC組和miR-383-5p+pcDNA-KIF3B組細胞增殖、克隆形成和凋亡檢測結果(n=9)

3 討論

研究[10]表明miR-383-5p在胃癌細胞中表達下調，其低表達可促進胃癌細胞的增殖及遷移。miR-383-5p表達降低還可通過靶向MAL2促進口腔鱗狀細胞癌的發展[11]。miR-383-5p過表達可通過靶向TRIM27抑制卵巢癌細胞的增殖[12]。本研究通過熒光素酶報告實驗證實KIF3B與miR-383-5p存在靶向關系。KIF3B在胰腺癌、肝細胞癌、前列腺癌中表達上調，抑制KIF3B表達可抑制腫瘤細胞的增殖及轉移[13-15]。

Cyclin D1可正向調控細胞周期，促進細胞周期由G1期進入S期，促進細胞增殖[16]。Caspase-3在細胞凋亡過程中發揮重要調控作用，其級聯反應被激活后，Cleaved-Caspase-3表達升高，反映細胞凋亡增加[17]。本研究發現，皮膚鱗狀細胞癌細胞中miR-383-5p表達下調，KIF3B表達上調；miR-383-5p過表達后皮膚鱗狀細胞癌SCC13細胞增殖率和克隆形成能力降低，凋亡率增加，同時Cyclin D1表達降低，Cleaved-Caspase-3表達增強；抑制KIF3B表達后SCC13細胞增殖能力減弱，細胞凋亡率升高，Cyclin D1表達降低，Cleaved-Caspase-3表達升高；進一步分析顯示KIF3B過表達可逆轉miR-383-5p過表達對SCC13細胞增殖、克隆形成及凋亡的影響。本研究結果提示，miR-383-5p在皮膚鱗狀細胞癌中可能發揮抑癌基因的作用，而KIF3B可能發揮癌基因作用，miR-383-5p可能通過靶向KIF3B，下調Cyclin D1表達，從而誘導SCC13細胞凋亡，抑制其增殖。

綜上所述，皮膚鱗狀細胞癌細胞中miR-383-5p表達下調，KIF3B表達上調，miR-383-5p可靶向干擾KIF3B表達，發揮抗皮膚鱗狀細胞癌增殖的作用，miR-383-5p可能成為皮膚鱗狀細胞癌靶向治療的潛在靶點。