基于Cas9-Free的擬南芥ALB3基因編輯載體構建及驗證

馬銘賽，布梁灝，陳自銀，黃嘉玲，歐陽樂軍，李莉梅，王玉濤

(1.喀什大學 生命與地理科學學院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態重點實驗室，新疆 喀什 844000；3.廣東石油化工學院 生物與食品工程學院，廣東 茂名 525000)

植物葉色突變與光合作用密切相關，葉色突變體的獲得為研究植物的光合作用途徑以及生理代謝過程提供了關鍵材料[1]。ALB3即ALBINO3，可能參與葉綠體的生物發生，在植物的衰老過程中發揮重要作用。其編碼產物與植物葉綠體蛋白相關的細菌膜蛋白YidC以及酵母菌OXA1蛋白具有序列相似性，具有高度保守的結構域，位于葉綠體類囊體膜上，參與葉綠體酶復合體的組裝[2]。因此，ALB3的缺失可使擬南芥葉綠體發育異常，導致擬南芥葉片白化。

擬南芥ALB3突變體于1993年由Long等[3]首次得到，其利用玉米轉座子系統Ac/Ds作為誘變劑，Ds的插入導致擬南芥產生白化現象，從而得到ALB3純合突變體，利用此種方法獲取突變體耗時且過程繁瑣，純合突變體幼苗生長在土壤中會致死，但當培養在萌發培養基(GM培養基)時，ALB3純合突變體可以長出大約12片葉子，偶然會開花，但依舊不育[2]。隨后，證明ALB3是葉綠體分化重要的核基因，突變可導致類囊體不能正常發生[2]。近些年來，關于擬南芥ALB3的研究極少，這可能與難以獲得ALB3突變體且突變體容易致死有關，但是關于ALB3的研究相對較多，比如ALB3膜插入酶的C端可以聚集cpSRP43到類囊體膜[4]；擬南芥ALB3與亞碲酸鉀抗性C蛋白共同參與光系統Ⅱ蛋白合成[5]；擬南芥ALB3不需要保守的帶正電荷的殘基來功能性地補充大腸桿菌YidC消耗菌株或促進YidC依賴性膜蛋白的插入[6]；植物和藻類葉綠素合成酶在集胞藻中起作用并可與YidC/Alb3膜插入酶相互作用[7]； ALB3轉位酶的基質結構域以高親和力結合并調節cpSRP54·cpFtsY復合物中的GTP水解等[8]。上述報道都為進一步研究ALB3的功能奠定了基礎。

為了更高效地對擬南芥ALB3進行定點編輯，建立一種更高效、安全的基因編輯體系，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建一種帶有紅色熒光蛋白基因mCherry且可敲除擬南芥ALB3的載體，利用可視化與分子生物學相結合的方法快速篩選突變幼苗，大大節省了操作步驟，提高了工作效率，為快速獲取不含外源轉化元件的基因編輯后代提供借鑒與參考。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料

本試驗所用的帶有熒光篩選標記基因mCherry的質粒pHDE-mCherry由加州大學(圣地亞哥分校)Professor Zhao贈送，DH5α大腸桿菌感受態細胞和GV3101農桿菌感受態細胞分別購自廣州鼎國生物技術有限公司和上海維地生物技術有限公司，Col-0野生型擬南芥生長于廣東石油化工學院植物培養室。

1.2 主要試驗試劑

質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TaqDNA Polymerase(ET101)以及DNA Marker購于北京天根生化科技有限公司；卡那霉素和DNA Loading Buffer于上海生工生物工程股份有限公司購置，Epicentre T5 exonuclease、NEB Taq DNA Ligase、BsaⅠ限制性內切酶以及NEB Phusion DNA polymerase均購于New England Biolabs公司(美國)，二硫蘇糖醇(DTT)購于北京碧云天生物技術公司。

1.3 靶位點的設計

從NCBI上下載擬南芥ALB3基因序列(NC_003071.7)，并以此為目標序列，通過CRISPR/Cas target在線設計網站(http：//crispr.dbcls.jp/)設計ALB3基因的2個Target位點，Target位點共包含23個堿基，形式如G-N19-NGG，第一個堿基G為小RNA轉錄起始位點，G-N19為插入載體的gRNA序列，NGG為PAM(Proto-spacer adjacent motif)序列，是Cas9基因的識別位點，即下劃線位置。Target1：5′-GTCCGTCACAGTGGAGTAGGAGG-3′；Target2：5′-CCTCTGCCGAGCAGCTATAGTGG-3′。

1.4 引物設計

試驗所用引物在Primer primer 5軟件上設計，由上海生工生物工程股份有限公司進行合成(表1)。

表1 試驗所用引物序列

1.5 pHDE-mCherry-ALB3表達載體的構建

1.5.1ALB3sgRNA片段的擴增 以pCBC質粒(含gRNA)為模板，ALB3-F和ALB3-R為引物，進行PCR擴增，反應程序：預變性94 ℃ 4 min，35個循環(變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，總延伸72 ℃ 2 min，4 ℃ 保存。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢驗，然后將檢驗成功的PCR產物(目的條帶)用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收。

1.5.2 質粒pHDE-mchenry的酶切及同源重組 用BasⅠ酶對pHDE-mCherry質粒進行酶切，20 μL體系，37 ℃反應4 h，以未酶切質粒為對照，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行驗證。

將1.5.1純化回收所得到的ALB3sgRNA片段與酶切產物進行同源重組，4.5 μL體系(重組酶3 μL，酶切質粒0.3 μL，ALB3sgRNA片段1.2 μL)，50 ℃水浴1 h。

1.5.3 重組產物轉化大腸桿菌以及菌液PCR鑒定 利用熱擊法將重組產物導入DH5感受態細胞，方法參照廣州鼎國生物技術有限公司DH5α感受態使用說明(產品編號MCC001)，將轉化后的DH5α感受態細胞在LB固體培養基上(含卡那霉素)培養12 h，挑選單菌落并進行PCR鑒定，反應程序同1.5.1。

1.5.4 重組質粒pHDE-mCherry-ALB3的提取與陽性重組子鑒定 將菌液PCR鑒定結果為陽性的菌液在LB液體培養基中(含50 mg/mL卡那霉素，卡那霉素與LB液體培養基的體積比為1/1000)擴大培養，并于37 ℃搖菌12 h，用質粒小提試劑盒提取重組質粒，進行質粒PCR鑒定，反應條件同菌液PCR。

挑選質量較好的陽性重組質粒送至生工生物工程股份有限公司(廣州)測序，并用Mega 6.06軟件進行序列比對驗證。

1.6 擬南芥的轉化

1.6.1 重組質粒轉化農桿菌及浸染液的配制 將測序成功的質粒轉入農桿菌感受態細胞，轉化方法參照上海唯地生物技術有限公司說明書(產品編號AC1001)，將轉化后的農桿菌GV3103感受態細胞于LB固體培養基上(含卡那霉素和利福平)于28 ℃培養48 h，挑取單菌落并進行PCR鑒定。反應程序同1.5.1。

經瓊脂糖凝膠電泳驗證，挑選條帶質量最好的菌液于LB液體培養基(含卡那霉素和利福平)中擴繁培養，28 ℃搖菌16 h。收集菌體，重懸于100 mL浸染緩沖液(5%的蔗糖溶液，0.02%的Silwet L-77)中，浸染液即配制完成。

1.6.2 擬南芥的浸染 將Col-0野生型擬南芥種子進行種植，出現花蕾后打頂，待側枝出現花蕾后，于浸染前1 d將所有開花的花朵以及莢果剪除。

用農桿菌浸染液浸染花苞，輕輕攪動1～2 min后取出，將葉片以及莖上的殘留液體用吸水紙吸除，暗培養48 h后正常培養，待新一批花苞長出時再次浸染。

1.7 轉化后代的篩選與鑒定

1.7.1 轉化T0種子的可視化篩選 收取轉化后的擬南芥種子，命名為T0種子，利用倒置熒光顯微鏡在T0種子中篩選帶有紅色熒光的種子并種植，得到T1植株。

1.7.2 突變植株的篩選及鑒定 觀察T1植株的表型是否與野生型植株有所異同，并剪取T1植株(尤其是表型特殊的)幼嫩葉片，提取植株的DNA，以此為模板，利用ALB3-GT1和ALB3-GT2這對鑒定引物對目標序列進行PCR擴增，反應程序：預變性94 ℃ 4 min，35個循環(變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，總延伸72 ℃ 2 min，4 ℃ 保存。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對目的條帶的大小進行驗證，確認是否將目標基因ALB3敲除成功。然后以Cas9-F和Cas9-R這對引物對已敲除ALB3的突變植物進行PCR擴增，反應程序：預變性94 ℃ 4 min，35個循環(變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，總延伸72 ℃ 2 min，4 ℃ 保存。驗證其是否攜帶外源轉化元件Cas9蛋白。

利用倒置熒光顯微鏡篩選T1種子中不帶熒光的種子進行種植，并對其幼苗(T2幼苗)進行ALB3敲除驗證以及是否攜帶外源轉化元件Cas9蛋白鑒定，方法同T1植株。

2 結果與分析

2.1 pHDE-mCherry-ALB3表達載體的構建結果

BsaⅠ酶切pHDE-mCherry質粒(圖1-A)，酶切后因質粒線性化，電泳遷移率慢于酶切前。經PCR擴增目的基因ALB3sgRNA(圖1-B)，條帶大小為500～750 bp，與預期擴增長度592 bp相一致，切膠回收后可與酶切產物同源重組。

重組產物轉化DH5α感受態細胞后，菌液PCR結果(圖1-C)顯示，擴增條帶大小為500～750 bp，與預期(592 bp)相符，且陽性率為100%。

挑選目的條帶質量較好的菌液擴繁培養，提取質粒并對質粒進行PCR鑒定(圖1-D)，條帶大小符合預期，初步判定pHDE-mCherry-ALB3表達載體構建成功。送樣測序后，通過序列比對(圖2)，進一步確認pHDE-mCherry-ALB3表達載體構建成功。

A.ALB3sgRNA片段的PCR擴增：M.DL2000 DNA Marker；B.BsaⅠ酶切pHDE-mCherry質粒電泳結果: 1.未酶切的pHDE-mCherry質粒;2.BsaⅠ酶切的pHDE-mCherry質粒；C.pHDE-mCherry-ALB3重組質粒菌液PCR鑒定結果:M.DL2000 DNA Marker; 1-6.重組質粒轉化菌液 PCR結果;7.陽性對照; 8.陰性對照；D.重組載體pHDE-mCherry-ALB3PCR鑒定結果:M.DL2000 DNA Marker;1.陽性對照; 2.陰性對照;3-7.重組質粒pHDE-mCherry-ALB3PCR結果。

A.The PCR amplification result ofALB3sgRNA sequence:M.DL2000 DNA Marker; B.TheBsaⅠ digestion result of pHDE-mCherryplasmid: 1. Original pHDE-mCherryplasmid;2.pHDE-mCherryplasmid digested withBsaⅠ enzyme; C.The bacterial so lution PCR identification results of pHDE-mCherry-ALB3recombinant plasmid:M.DL2000 DNA Marker; 1-6. PCR result of recombinant plasmid transforming bacterial solution;7.Positive control; 8. Negative control; D.The PCR identification result of recombinant vector pHDE-mCherry-ALB3:M. DL2000 DNA Marker;1.Positive control; 2.Negative control;3-7. PCR result of recombinant plasmid pHDE-mCherry-ALB3.

圖1 pHDE-mCherry-ALB3表達載體的構建

Fig.1 Construction of pHDE-mCherry-ALB3expression vector

圖2 序列比對結果

2.2 重組質粒pHDE-mCherry-ALB3轉化農桿菌結果

重組質粒轉化農桿菌GV3103感受態細胞后，為了驗證是否成功轉化，對其菌液進行PCR鑒定，鑒定結果(圖3)顯示條帶大小在500～750 bp，符合預期大小，說明工程菌轉化成功。

M.DL2000 DNA Marker；1-6.重組質粒pHDE-mCherry-ALB3轉化農桿菌 PCR結果；7.陽性對照；8.陰性對照。

2.3 轉化后代的可視化篩選

2.3.1 陽性轉化種子篩選 本試驗所用表達載體中含有紅色熒光蛋白mCherry基因，成功轉化的種子在580 nm激發光的照射下可激發出紅色熒光(圖4)，沒有轉化成功的種子沒有熒光，極大地提高了陽性轉化后代的篩選效率。

圖4 倒置熒光顯微鏡下種子顯色情況

2.3.2 編輯后代的表型及分子鑒定結果 將篩選得到的紅色熒光種子種植在培養基上，萌發后觀察到一些幼苗的葉子極淡，為淺黃色(圖5)，將這些幼苗移植到土壤中生長一段時間，葉子顏色更淡，為白色(圖6)，表現為ALB3基因缺失的表型。

圖5 培養基中突變幼苗與野生幼苗生長情況

圖6 土壤中突變幼苗與野生幼苗生長情況

為驗證ALB3基因編輯情況，對上述白化植株進行 PCR鑒定(圖7-A)。由于本試驗中對ALB3基因設計了2個編輯位點，從而實現大片段的敲除，在2個編輯位點上下游設計引物進行PCR擴增時，野生型對照(泳道9)擴增得到一個大片段，而泳道8擴增片段大小明顯小于野生植株，為ALB3基因中間敲除后擴增得到的小片段，即為純合突變，泳道1和5擴增得到一大一小2個片段，表明這2個植株為雜合突變。對含紅色熒光種子的T1植株進行外源轉化元件Cas9蛋白的檢驗(圖7-B)，均能擴增得到Cas9基因片段，說明T1植株均含外源轉化元件Cas9蛋白。

A.T1突變體植株的基因敲除鑒定:M.DL1200 DNA Marker;1和5.T1雜合突變幼苗; 8.T1純合突變幼苗;2-4.T1未發生突變幼苗;9.野生幼苗(對照組); B.T1突變體植株的Cas9檢驗:M.DL1200 DNA Marker; 1-6.T1突變幼苗; 7.野生幼苗(對照組)。

A. Gene knockout identification of T1mutant plants:M. DL1200 DNA Marker; 1 and 5.T1generation homozygous mutant seedlings; 8.Heterozygote mutants in the T1generation；2-4. Mutants of T1generation without mutation;9.Wild seedlings (control group); B. Identification of T1generation mutant plants withCas9:M.DL1200 DNA Marker;1-6. T1generation mutant seedlings;7.Wild seedlings (control group).

圖7 T1突變體植株分子鑒定結果

Fig.7 Molecular identification results of T1mutant plants

對T2幼苗進行ALB3敲除鑒定(圖8-A)和外源轉化元件Cas9蛋白檢驗(圖8-B)，發現純合突變幼苗都不含Cas9基因，由此成功獲得不含外源轉化元件Cas9蛋白的純合突變植株。但是突變植株經過一段時間的培養后，一直處于只有2片葉子的狀態，無法存活，這可能是ALB3基因的缺失引起的，需深入研究。

A. T2突變體植株的基因敲除鑒定:M.DL1200 DNA Marker;1.野生幼苗(對照組);2-3.T2未發生突變幼苗;4-7. T2純合突變幼苗; B. T2突變體植株的Cas9檢驗: M.DL1200 DNA Marker; 1-7.T2突變幼苗;8.野生幼苗(對照組)。

A.Gene knockout identification of T2mutant plants:M.DL1200 DNA Marker；1.Wild seedlings (control group)；2-3. Mutants of T2generation without mutation；4-7. T2generation homozygous mutant seedlings；B.Identification of T2generation mutant plants withCas9：M. DL1200 DNA Marker；1-7. T2generation mutant seedlings；8.Wild seedlings (control group).

圖8 T2突變體植株分子鑒定結果

Fig.8 Molecular identification results of T2mutant plants

3 討論

3.1 mCherry在篩選突變種子中的應用優勢

mCherry為一種紅色熒光蛋白基因，來自于蘑菇珊瑚(Mushroom coral)，所編碼的蛋白具有很強的光穩定性[9]。本研究在所構載體中引入mCherry，利用種皮特異性啟動子At2S3促使其表達，在熒光顯微鏡特定波長的激發下，應用外源轉化元件中帶有熒光蛋白的標記特性，篩選擬南芥轉化初期帶有熒光的種子，實現對突變體的可視化篩選，提高獲得轉化后代陽性植株比例，提高篩選效率。這種通過可視化熒光篩選標記來判斷種子中是否含有CRISPR/Cas9表達系統的方法簡單易行，準確性高，對基因編輯事件的檢測在經過可視化篩選后只需要進行簡單的PCR驗證，即可確定是否獲得Cas9-Free的突變后代，極大地提高了工作效率，為有性繁殖作物基因編輯后代中獲得新種質資源提供了一種全新的技術方法，具有一定的創新性。

3.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術的應用優勢

CRISPR/Cas9技術作為一種有效的基因編輯工具，具有操作簡單、高效性和特異性等其他基因編輯工具不可比擬的優勢[10-14]。利用TALEN和CRISPR/Cas9 2種基因編輯技術分別對同一種基因進行改造，效率分別為0～34%，51%～79%，充分證明了CRISPR/Cas9技術的高效性，且相較于前者，CRISPR/Cas9技術操作簡單[15]。目前，CRISPR/Cas9技術已在大豆[16]、水稻[17-18]、亞麻[19]、伴礦景天[20]、木薯[21]、甘藍[22]等植物中實現了基因編輯，應用廣泛，為植物特定基因的功能探究以及新種質資源的創建提供了技術參考。

本研究設計2個sgRNA，使其同時識別靶基因ALB3的2個不同位點，構建一種帶有熒光篩選標記且可實現靶基因敲除的基因編輯體系。通過轉化擬南芥，挑選轉化后種皮上帶有紅色熒光標記的T0陽性種子進行種植，得到T1幼苗，經觀察植株表型以及PCR鑒定得到純合突變幼苗，但此時純合突變幼苗存在Cas9表達核且會致死，為了得到不攜帶Cas9表達核的純合突變體，需進一步挑選T1植株中不帶熒光的種子進行培育，得到的T2幼苗，經表型觀察以及PCR鑒定，得到純合突變幼苗，利用PCR技術對Cas9基因進行檢測，Cas9基因已去除，說明外源轉化元件Cas9蛋白已隨著配子產生過程中染色體的分離而去除，由此得到無Cas9蛋白外源轉化元件的純合突變體幼苗，可穩定遺傳。本技術成功分離出外源轉化元件Cas9蛋白，獲得可穩定遺傳的純合突變體。為探索ALB3在光合作用中的作用提供了理想材料，并為研究ALB3在植物生長發育的作用以及新種質資源的建立奠定了基礎。