溫室黃瓜連作對土壤真菌數量和群落結構的影響

李玉嬌，劉 星，吳大付，陳碧華，任秀娟，唐 蛟

(1.河南科技學院 資源與環境學院，河南 新鄉 453003； 2.河南科技學院 園藝園林學院，河南 新鄉 453003)

設施蔬菜栽培是現代農業生產的重要組成部分，能夠顯著提高自然資源利用效率，增加農民經濟收益[1]。中國是全世界最大的設施蔬菜生產國，且種植規模仍以每年10%左右的速度增長。2014 年全國設施蔬菜種植面積達到386×104hm2，產值超7 000億元，從業人員4 000萬以上[2]。根據農業農村部《全國設施蔬菜重點區域發展規劃(2015-2020年)》，到2020年，全國將新增設施蔬菜生產面積7.0×104hm2，總產值超過10 000億元，其收入占農民人均純收入10%以上。在近年來農業供給側結構性改革的大背景下，促進設施蔬菜行業的提質增效和健康發展對于解決三農問題、促進返鄉就業和實現鄉村振興的戰略目標具有重要意義。然而就整個設施蔬菜產業鏈而言，在生產環節由于長期集約化種植所帶來的連作障礙問題依然是限制我國設施蔬菜產業可持續發展的重要瓶頸之一[3]。因此，迫切需要闡明設施蔬菜連作障礙形成機理。

集約化設施蔬菜栽培呈現土壤耕作頻繁、復種指數高和水、肥供應量大的顯著特點，菜農受利益驅使，長期連作種植導致土壤惡化、病蟲害猖獗、經濟產量降低和品質下降等嚴重問題。健康的土壤環境是作物高產高效和農業可持續發展的基礎，盡管不同作物(品種)或地區之間的連作障礙機理可能存在差別，但主要源自土壤[4]。土壤是組分多樣化、具有高度異質性和復雜性且易于擾動的生態系統，長期連作常常導致土壤性質劣變，并對作物生長發育形成負反饋調節[5-6]，闡明設施蔬菜連作條件下土壤障礙因子(類型)是理清連作障礙機理并發展形成高效的連作土壤障礙因子消減技術的重要前提。早前的學者也從設施連作土壤理化和生化性質變化角度得到了大量研究結論，諸如土壤物理結構惡化(土壤板結和團聚體穩定性降低)、養分不均衡吸收和作物根區養分虧缺、土壤酸化和次生鹽漬化、土壤酶活性衰減、化感(自毒)作用、土傳致病菌滋生和根結線蟲富集等[7-8]。

微生物是土壤生態系統的重要成員，其在遺傳、結構和功能上具有高度的多樣性，有效驅動著有機質分解、養分循環、污染物降解和能量流動等一系列土壤生物學過程，同時在抑制土傳病害和維持作物健康方面發揮重要作用。隨著分子生物學技術的進步和組學技術的應用，土壤微生物及其群落組成和結構在連作種植條件下的行為變化特征越來越受到研究者的關注。研究業已證明，長期連作能夠顯著改變土壤中微生物數量和群落結構，表現為降低土壤微生物多樣性，并隨著連作年限延長，土壤微生物群落結構顯著改變，從“細菌型”向“真菌型”轉變，土傳病害顯著增加[9-15]。進一步研究顯示，長期連作導致土壤微生物群落結構受到破壞，種間互作呈現無序和弱化的狀態，且有益微生物或具有潛在生防能力的微生物豐度降低，對土傳致病菌的競爭能力下降[16-24]。然而，微生物受作物種類(品種)、土壤類型(質地)、地理環境和氣候、耕作和栽培條件、養分供應等各種因素影響較大，不同地區間土壤微生物種類、數量、多樣性和組成結構等存在明顯差異，因而其對連作種植的響應特征可能存在差別。豫北地區是河南省劃定的蔬菜種植產業優勢區，但區域內設施蔬菜連作障礙的土壤微生態學機理迄今為止鮮有報道。鑒于此，以黃瓜這一傳統的設施蔬菜主栽作物為研究對象，通過采集具有不同黃瓜連作年限的土壤樣品，結合Real-time PCR和高通量測序等技術手段，研究了設施黃瓜連作對土壤真菌數量和群落結構的影響，旨在為闡明區域內設施蔬菜連作障礙機理和發展相關的連作土壤障礙因子消減技術提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗區概況

研究區域為河南省新鄉市牧野區朱莊屯村(地理坐標35°21′12″ N，113°55′2″ E，平均海拔約56 m)，供試土壤為壤質潮土。該區地處黃河中下游，屬于暖溫帶大陸性季風氣候，四季分明，雨熱同季，降水集中，年均氣溫14 ℃，全年無霜期220 d，年均降水量573.4 mm，水資源豐富，土層深厚，土壤肥沃。設施蔬菜方面，主要栽培黃瓜、番茄、辣椒和茄子等，種植結構相對單一，且大多處于長期連續種植狀態，連作障礙問題突出，枯萎病、黃萎病和青枯病等土傳病害較為普遍。

1.2 試驗設計和樣品采集

在試驗區內選擇連作年限分別為1，5，10，15，20 a的黃瓜種植大棚各3個，用土鉆按五點取樣法在每個棚內采集混合樣品1個，采樣深度為0～20 cm，即每個連作年限處理下共得到了相當于3次重復的土壤樣本，5個連作年限處理分別用CC1、CC5、CC10、CC15和CC20表示。CC1地塊前茬作物為玉米，2017年春季開始轉為溫室黃瓜生產。土樣采集在2017年秋季黃瓜收獲時進行，以盡可能排除植株根系和其他一些農業管理措施對土壤樣本的潛在影響。將采集的新鮮土樣去除石塊、動植物殘體等雜質后，裝入干凈的密封袋，帶回實驗室過1 mm篩，將過篩后土壤分成3份，一份儲存于-80 ℃冰箱內用于后續的微生物分子生物學分析，一份在室溫下風干用于測定土壤常規理化性質，另一份立刻用于測定土壤礦質氮含量和相關生化性質。供試土壤理化和生化性質測定方法見Liu等[25]的報道。為最大限度地消除不同地塊和年份間種植和管理措施對土壤取樣和后續數據分析的影響，本研究中所有溫室地塊均來自相同的農民種植合作社，彼此相距較近，且一直采用當地統一的耕作種植和農藝管理方法，具體細節見文獻[25]。

1.3 土壤真菌數量測定

按產品說明書上的步驟，使用PowerSoil DNA試劑盒提取微生物總DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測DNA的質量和純度。將提取的DNA溶解在50 μL洗脫緩沖液中并于-20 ℃冰箱中保存備用。真菌PCR擴增采用18S rRNA基因V5-V7區特異性通用引物對SSU0817F/1196R[26]。熒光定量PCR采用ABI 7500 實時定量PCR儀進行，每個土樣重復3次，擴增體系(20 μL)如下： 10.0 μL ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(2×)，引物各0.8 μL(5 μmol/L)，2 μL DNA模板，6.4 μL ddH2O。擴增條件為： 95 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環。在每一循環退火階段收集熒光，實時檢測反應并且記錄熒光信號變化，得出擴增產物熔解曲線。所得產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段大小為425 bp，通過熔解曲線驗證擴增專一性。擴增產物經純化后并連接至pMD18-T克隆載體上，轉化大腸桿菌，挑取轉化后平板上的白色單克隆提取質粒，測序確定插入DNA片段是否正確。采取10倍梯度稀釋標準質粒，用10-2～10-7稀釋液制備標準曲線。確定閾值和基線，繪制標準曲線，橫坐標為基因拷貝數的常用對數，縱坐標為熒光定量PCR測得的Ct值。PCR擴增效率93.96%，標準曲線R2為0.999 4。通過Ct值，計算待測樣品中真菌數量，并進一步計算各土壤樣品的真菌和細菌數量比值，細菌數量已在前期文獻中報道[25]，此處不再重復。

1.4 土壤真菌群落結構和生物信息學分析

采用高通量擴增子測序方法(Illumina Miseq PE300高通量測序平臺)評估不同連作年限處理下土壤真菌的多樣性和群落結構。以土壤微生物總DNA為模板進行PCR擴增，擴增引物對為SSU0817F/1196R[26]。PCR擴增體系(20 μL)為： 4 μL FastPfu Buffer(5×)，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL Bovine serum albumin，引物各0.8 μL(5 μmol/L)，10 ng 模板DNA和11.2 μL ddH2O。PCR擴增反應條件為： 95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；最后72 ℃再延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證，采用Agarose Gel DNA純化試劑盒進行純化，并用分光光度計測定濃度，最后將PCR產物等量混合，送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序。

將高通量測序下機原始序列進行雙端序列拼接和質量過濾，使用QIIME軟件分析[27]。對序列進行質控，刪除尾部質量值20以下、長度小于200 bp的序列； 根據序列首尾兩端的標簽和引物區分樣品，并調整序列方向，序列標簽允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2，將序列分配至不同處理樣品；使用Uclust的方法按照97%的相似度進行可操作分類單元(Operational taxonomic units OTU)聚類，每個OTU中數量最多的序列被挑選為代表序列；為得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學比對，以Silva 128/18S_Eukaryota數據庫為參考，對OTU代表序列進行比對分類鑒定，分類置信度閾值為70%。本研究15個土壤樣本總計獲得642 481條高質量序列，序列平均長度為401 bp；對所得到的高質量序列，按最小樣本序列數抽平(每個土壤樣本31 374條序列)，用于后續的α多樣性和β多樣性分析。根據OTU列表中各樣品物種豐度情況，應用軟件MOTHUR計算菌群α多樣性指數。使用QIIME軟件，對Weighted的UniFrac距離矩陣進行UPGMA聚類分析?；贐ray-curtis距離算法的主坐標分析(Principal coordinates analysis，PCoA)用于比較不同處理土壤真菌群落結構差異，并利用相似度分析(Analysis of similarities，ANOSIM)檢驗處理間真菌群落結構的差異顯著性。對少數平均豐度較高且在Silva數據庫中未能充分比對的OTU，在NCBI GenBank數據庫中進行手工比對。通過Canoco 4.5軟件對土壤理化性質和真菌群落結構及多樣性進行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。

1.5 數據處理

試驗數據計算和圖表繪制在Microsoft Excel 2007和SigmaPlot 12.0軟件上進行，使用SPSS 21.0軟件進行處理間差異的顯著性檢驗(One-way，P< 0.05)。圖表中試驗結果采用平均值±標準差表示(n= 3)。不同數據間的相關性分析采用常見的一元回歸模型進行。真菌豐度采用常用對數轉換來表示。本研究所獲得原始測序數據已上傳至NCBI SRA數據庫，登錄號為SRP145523。

2 結果與分析

2.1 設施黃瓜連作對土壤真菌豐度和真細比的影響

溫室黃瓜連作顯著改變了土壤真菌數量(圖1)。較CC1相比，CC10和CC15真菌數量分別顯著增加4.42%和4.18%，但CC5和CC20處理均無顯著差異。各處理土壤真細比變化趨勢與真菌數量一致，CC10和CC15處理較CC1分別顯著增加3.45%和3.77%。同時，回歸分析證明土壤真菌數量和真細比均表現出隨連作年限延長先增加后降低的拋物線趨勢(P< 0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表1-4同。

2.2 設施黃瓜連作對土壤真菌群落α多樣性和β多樣性的影響

由表1可知，CC5～CC20處理土壤真菌群落OTU數量和群落的Shannon、Simpson、Ace和Chao1指數總體上與CC1均無顯著差異，表明真菌群落的α多樣性并不受溫室黃瓜長期連作影響。但從群落OTU組成上來看(圖2)，CC1～CC20各處理真菌群落共享的OTU數量為118個，獨有的OTU數量，5個處理依次為8，3，1，2，2個，分別占總觀測到OTU數量的5.52%，2.12%，0.73%，1.48%和1.31%，隨著溫室黃瓜連作年限延長，群落中獨有的OTU比例降低，顯示溫室黃瓜連作改變了真菌群落組成。層級聚類(圖3-A)和PCoA分析(圖3-B)證明，溫室黃瓜連作顯著改變了真菌群落的β多樣性，且各連作年限處理間真菌群落結構差異達到顯著水平。

表1 溫室黃瓜連作對土壤真菌群落α多樣性的影響

圖2 不同溫室黃瓜連作年限下土壤真菌群落共有和獨有的OTU數目

2.3 設施黃瓜連作對土壤真菌群落成員的影響

真菌群落中平均相對豐度超過1%的真菌門分別為子囊菌門、未分類真菌(Unclassified_k_Fungi)、未分類真菌(Norank_k_Fungi)、擔子菌門、纖毛門和未分類真核生物(Unclassified_d_Eukaryota),這6個門共占總回收序列量的98.48%(表2)。其中，子囊菌門是所有供試土壤中最具優勢的真菌門，其平均相對豐度占到總回收序列的87.22%，但各連作年限處理下子囊菌門的平均相對豐度并無顯著差異。與CC1相比，CC5～CC20處理擔子菌門平均相對豐度無顯著變化。CC20處理纖毛門平均相對豐度較CC1顯著增加302.20%，但CC5～CC15無顯著差異。

在目水平下，群落中平均相對豐度超過0.01%的真菌目共有18個，占總回收序列量的98.20%(表3)；平均相對豐度超過10%的真菌目共有4個，分別為小囊菌目、盤菌目、未分類子囊菌(Norank_p_Ascomycota)和糞殼菌目,占總回收序列量的70.05%。小囊菌目平均相對豐度在CC5～CC20下較CC1分別顯著增加159.35%，148.99%，85.20%和60.20%，且整體上隨連作年限延長先增加后降低。溫室黃瓜連作顯著降低了未分類子囊菌平均相對豐度，CC5～CC20與CC1相比降幅分別達到54.62%，40.45%，55.46%和40.37%。糞殼菌目平均相對豐度表現出隨連作年限延長先降低后增加的趨勢，CC5、CC10和CC15處理與CC1相比分別顯著降低59.05%，55.06%和30.27%，而CC20處理則顯著增加34.54%。與此同時，爪甲團囊菌目、肉座菌目和Conthreep的平均相對豐度也均隨著連作年限延長呈現顯著變化。

圖3 土壤真菌群落在OTU水平的層級聚類(A)和主成分分析(B)

表2 溫室黃瓜連作對門水平下土壤真菌群落成員平均相對豐度的影響

Tab.2 Effects of continuous cropping cucumber on average relative abundances of fungal community members at phylum level%

門Phylum平均相對豐度 Average relative abundanceCC1CC5CC10CC15CC20平均 Mean子囊菌門 Ascomycota87.32±4.32a89.36±0.48a86.79±1.56a86.69±1.38a85.97±2.75a87.22未分類真菌 Unclassified_k_Fungi4.15±2.52ab1.26±0.55c5.77±0.89a3.14±0.70bc1.80±0.23bc3.22未分類真菌 Norank_k_Fungi3.43±1.62a1.80±0.56b3.73±0.27a3.65±0.28a3.34±0.53a3.19擔子菌門 Basidiomycota1.78±0.99ab3.50±1.17a0.82±0.89b2.21±0.92ab1.11±1.27b1.88纖毛門 Ciliophora0.91±0.24b2.00±0.53b0.95±0.42b1.83±0.95b3.66±1.28a1.87未分類真核生物 Unclassified_d_Eukaryota0.76±0.20b1.12±0.11b0.87±0.14b1.10±0.26b1.59±0.33a1.09其他Others1.64±0.41b0.97±0.08b1.07±0.14b1.38±0.17b2.53±0.74a1.52

表3 溫室黃瓜連作對目水平下土壤真菌群落成員平均相對豐度的影響

在屬水平上，群落中最豐富的前20個真菌屬共占總回收序列量的96%左右(表4)。平均相對豐度超過10%的真菌屬有4個，分別為假埃希氏菌屬、Lasiobolidium、赭霉屬和毛殼菌屬，這4個屬共占總回收序列量的64.24%。假埃希氏菌屬平均相對豐度在CC1處理下最低，CC5～CC20處理較其分別顯著增加177.26%，159.57%，97.65%和65.16%，并在整體上表現出隨連作年限延長先增加后降低的趨勢。Lasiobolidium平均相對豐度在各連作年限處理下無顯著變化。與CC1相比，溫室黃瓜連作年限增加顯著降低了赭霉屬的平均相對豐度。毛殼菌屬的平均相對豐度隨連作年限延長先降低后增加，CC5、CC10和CC15處理與CC1相比分別顯著降低58.60%，56.25%和30.88%，而CC20顯著增加35.51%。CC5處理與CC1相比顯著降低了Gelatinomyce、Polychytrium和下梳霉屬的平均相對豐度,但顯著增加了帚枝霉屬和隱囊菌屬的平均相對豐度。CC15處理下小不整球殼屬平均相對豐度顯著高于其他處理。CC20處理下根生壺菌屬平均相對豐度顯著高于其他處理。CC10處理較CC1顯著增加了Arachniotus、糞盤菌屬、瓶毛殼屬和Rhodoveronaea的平均相對豐度。此外, 溫室生產中常見的2種土傳致病真菌絲核菌屬和鐮刀菌屬也被檢出, 但二者的平均相對豐度均較低(<1%)。不同連作年限處理下絲核菌屬平均相對豐度并無顯著差異。鐮刀菌屬平均相對豐度在CC15處理下最高, 但與CC1相比無顯著變化。

2.4 土壤理化性質與真菌群落和群落成員的關系

豐度最高的前20個真菌屬中有12個與1個或多個土壤理化因子呈顯著或極顯著的線性相關關系(表5)。假埃希氏菌屬與有效磷和速效鉀呈顯著正相關； 赭霉屬與有機質、有效磷和速效鉀呈極顯著負相關； 小不整球殼屬與硝態氮呈極顯著正相關；Polychytrium、下梳霉屬和Rhodoveronaea與pH值呈顯著或極顯著負相關；Sarocladium和Arachniotus分別于速效鉀和pH值呈顯著正相關；Rhizophydium與有機質、有效磷和電導度呈顯著或極顯著正相關； 隱球菌屬與全氮呈顯著負相關；絲核菌屬與速效鉀呈顯著正相關；Remersonia與pH值呈顯著負相關。RDA分析表明(圖4)，土壤硝態氮(R2=0.721 2，P=0.001)、速效鉀(R2=0.699 8，P=0.002)和有機質(R2=0.391 0，P=0.048)含量顯著驅動著溫室黃瓜連作土壤的真菌群落結構變化，其余土壤理化因子(全氮、銨態氮、速效磷、pH值和電導度)對真菌群落結構變化的影響并不顯著(P>0.05)。

表4 溫室黃瓜連作對最豐富的20個真菌屬的平均相對豐度的影響

表5 最豐富的20個真菌屬的平均相對豐度與土壤理化性質的線性相關分析

注：ns.無顯著相關性；*.P<0.05；**.P<0.01。

Note： ns.No significant;*.P<0.05;**.P<0.01.

OM.有機質；TN.全氮；AN.銨態氮；NN.硝態氮；AP.有效磷；AK.有效鉀；pH.酸堿度；EC.電導度。

OM，TN，AN，NN，AP，AK，pH and EC represent organic matter，total nitrogen，ammonium nitrogen，nitrate nitrogen，available phosphorus，available potassium，pH，and electrical conductance，respectively.

圖4 土壤真菌群落結構與土壤理化因子的關系(冗余分析)

Fig.4 The relationship of soil fungal community structureand soil physiochemical factors based on RDA analysis

3 結論與討論

長期集約化連作生產常常導致作物生長發育受阻，經濟產量和品質降低，且土傳病害滋生，其中真菌型土傳病害表現尤為普遍[28-30]。大量基于可培養微生物和分子生物學方法進行的研究報道業已證明，土壤微生物區系與土傳真菌型致病菌積累和病害發生息息相關[31-38]。因此，本研究將溫室黃瓜連作條件下土壤真菌數量和群落結構作為研究的重點。實時熒光定量PCR結果表明，溫室黃瓜連作顯著影響了土壤真菌數量，并表現出隨連作年限延長先增加后降低的趨勢，這與Zhou等[14]的研究結果一致。真細比通常被認為是表征土壤肥力和健康的重要指標[39]，與真菌數量變化類似，真細比也隨連作年限延長先增后減，顯示土壤微生物區系結構受溫室黃瓜連作的顯著影響。值得注意的是，盡管早前較多的研究也證實長期溫室連作常常增加土壤真菌數量并提高真細比[40-41]，但本研究結果暗示土壤真菌數量和微生物區系結構受連作年限長短調控。有研究發現，一些作物的產量常常在一定連作年限后逐步得到自我恢復，并且連作障礙程度趨于減輕甚至消失，如大豆[42-43]和棉花[44-45]等，但其中相關的潛在機制尚不清晰，猜測可能與作物和土壤微生物二者在長期連作種植過程中的相互適應有關[45]。

高通量測序顯示，真菌群落的β多樣性與α多樣性相比對溫室黃瓜連作更為敏感。不同連作年限下土壤樣品真菌群落結構明顯變化，在層級聚類分析和PCoA圖中，CC5～CC20處理土壤樣品與CC1區分明顯，這些與早前學者在溫室黃瓜連作研究中通過PCR-DGGE方法所取得的結果一致[13-14]。但Yao等[15]基于群落水平生理多樣性(CLPP)和隨機擴增多態性DNA(RAPD)的方法研究表明，長期溫室黃瓜連作顯著降低了土壤微生物多樣性，推測供試土壤性質的不同以及方法學上的差異造成了這種不一致的研究結果。就真菌群落成員而言，少數的優勢成員支配著整個真菌群落，假埃希氏菌屬、Lasiobolidium、赭霉屬和毛殼菌屬共占總回收序列量的64.24%，它們作為真菌群落組成的基石在最大程度上決定著整個真菌群落對溫室黃瓜連作的響應。假埃希氏菌屬作為在屬水平下最豐富的群落成員，其平均相對豐度隨連作年限延長先增后降，這與土壤真菌數量變化一致。高通量測序結果也證明不同真菌群落成員對溫室黃瓜連作響應的差異性，這可能與土壤理化性質變化有關，不同的微生物種屬適應不同的生態位。相關分析的確證明，多數的優勢真菌群落成員均與土壤理化因子之間存在著廣泛的相關性。

微生物常常行使各種各樣的土壤生態功能并能夠提供生態服務。假埃希氏菌屬是土壤N2O排放的重要貢獻者[46]，早前的研究也證明，自毒物質(如香草醛)的添加能夠顯著降低黃瓜幼苗根際真菌群落中假埃希氏菌屬的平均相對豐度[47]。Lasiobolidium已被證明是設施番茄長期連作土壤中的優勢真菌屬[48]，這與本研究結果類似。高通量測序結果顯示，刨花楠(Machiluspauhoi)長期種植顯著改變土壤優勢真菌赭霉屬平均相對豐度[49]。毛殼菌是一種典型生防菌，可以產生抗生素和細胞壁降解酶，對一些土傳、氣傳病害起到防治作用[50]。在本試驗中，CC5、CC10、CC15處理下毛殼菌平均相對豐度較CC1顯著降低，而在CC20處理下又顯著回升，表明土壤一些有益菌的豐度受連作年限影響，但連作20 a以后毛殼菌平均相對豐度出現顯著回升的內在原因尚需進一步研究。此類現象在東北地區大豆中也有所報道，魏巍[43]研究表明，長期連作可形成根腐病抑制性土壤，減輕大豆根腐病發病程度，抑制病原鐮孢菌的生長。另外，前人的研究結果表明，隨著連作年限的增加，土壤中致病性真菌增多。馬云華等[51]對溫室黃瓜的研究發現，隨著連作年限的增加，土壤中引起黃瓜枯萎病的尖孢鐮刀菌逐漸成為優勢真菌生理群。本研究的結果顯示，土壤真菌群落中鐮刀菌(Fusariumsp.)的平均相對豐度較低，且CC5～CC20處理與CC1相比并未出現顯著差異；此外，另一種常見土傳致病菌絲核菌(Rhizoctoniasp.)的平均相對豐度在不同連作年限下也無顯著變化。推測可能與試驗區內菜農長期且高量的農藥使用有關。有意思的是，盡管常見的土傳致病真菌的豐度并未發生明顯的改變，但是對細菌的高通量測序結果顯示，一些重要的生防菌芽孢桿菌(Bacillussp.)和假單胞菌(Pseudomonassp.)的豐度隨連作年限延長顯著降低。因此，需要進一步闡明特征微生物在溫室蔬菜連作條件下的行為特征及其與土壤抑病性/致病性的關系。

本研究證明，硝態氮、速效鉀和有機質含量是驅動溫室黃瓜連作土壤真菌群落結構變化的主要因子。前期的研究結果已經證明[25]，長期的溫室黃瓜連作顯著增加了土壤硝態氮、速效鉀和有機質的含量。作為微生物的主要生境以及物質和能源的供應池，土壤環境變化直接驅動微生物組成和結構的變化，土壤微生物也對土壤理化因子擾動做出快速響應?？偟膩砜?，本研究結果也顯示了土壤真菌群落結構對由長期溫室黃瓜連作所導致的復雜的土壤理化環境變化的快速響應。