牦牛ACTA1基因啟動子區克隆、DNA甲基化與組織表達相關性分析

楊 勤，柴志欣，王吉坤，王 會，鐘金城

(西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是分布于青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區的特有且珍貴畜種，能適應高寒、低氧、強紫外線等高原惡劣生態環境以生存和繁衍后代，能充分利用高寒牧草資源為高原牧民提供肉、乳、毛、皮、役用等生產生活資料[1]，是當地牧民主要經濟來源。因此，開展牦牛遺傳資源保護與利用具有重要的科學和經濟價值，研究其生長發育及其調控機理對充分發揮牦牛品種優良特性和促進牧區畜牧產業發展具有重要意義。

α肌動蛋白1(Actin alpha 1，ACTA1)是肌動蛋白的一類異構形式，是構成骨骼肌收縮蛋白的重要成分，廣泛參與肌細絲組裝、骨骼肌纖維發育以及細胞和細胞器的運動等生理活動[2]。研究表明，ACTA1基因突變與人類多種肌肉疾病密切相關，如骨骼肌先天性肌病、橫紋肌疾病、桿狀體肌病與蓋肌病等[3-7]。近年來，國內外許多研究也對畜禽ACTA1基因進行了報道。Swery等[8]研究發現，ACTA1基因突變與斑馬的肌無力相關。Sibut等[9]研究表明，12月齡韓牛背最長肌中ACTA1基因表達水平顯著高于27月齡韓牛，ACTA1基因可能是調控韓牛肉質性狀的重要基因。Shin等[10]研究顯示，ACTA1基因在韓牛低等級大理石花紋牛肉中表達量顯著高于高等級大理石花紋個體，ACTA1基因可能是影響肉質性狀的候選基因。目前，有關ACTA1基因調控牦牛肉質性狀的分子機制尚未見報道。

DNA甲基化即在DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)作用下，將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)提供的甲基轉移到第5位胞嘧啶，而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。發生DNA甲基化修飾的主要位點是CpG二核苷酸序列的胞嘧啶上[11]。在基因核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達卻能發生可遺傳的變化[12]。DNA甲基化與生物體內重要基因表達調節密切相關，目前相關研究表明，DNA甲基化與基因的表達呈負相關，啟動子區和結構基因的高甲基化與基因的表達存在一定的負相關，而啟動子區低甲基化與轉錄活性正相關[13]。經證實，DNA甲基化在家畜生長發育過程中主要參與細胞新陳代謝活動以及眾多生長代謝和調控過程，與家畜肌肉生長發育和脂肪沉積等經濟性狀密切相關[14]。

本試驗以類烏齊牦牛、麥洼牦牛為研究對象，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測ACTA1基因在這2個牦牛群體各組織的表達差異；利用重亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite-sequencing PCR，BSP)檢測ACTA1基因在各組織的甲基化狀態，從表觀遺傳學角度分析ACTA1基因與牦牛肉質性狀的相關性，旨在為進一步揭示ACTA1基因對牦牛生長發育、肌肉發育等的調控作用，并為建立有效可靠的分子標記等提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與樣品采集

于西藏自治區昌都市類烏齊縣和四川省紅原縣分別選取3頭4.5歲類烏齊牦牛和麥洼牦牛，分別采集臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪6種組織，DEPC水清洗干凈，錫箔紙包裝后迅速置于液氮中保存，用于提取基因組DNA和總RNA。

1.2 主要試劑

TRIzol RNA提取試劑盒(Thermo)；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)；DNA純化回收試劑盒(TIANGEN)；反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis(Thermo Scientific)；瓊脂糖BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10(GENE COMPANYLTD)；DL2000 DNA Ladder(TaKaRa)；Loading Buffer(TaKaRa)；pMD19-T載體(TaKaRa)；DH5α大腸桿菌感受態細胞(TIANGEN)；質粒DNA提取試劑盒Plasmid Miniprep Plus Purification(GeneMark)；DNA甲基化處理試劑盒ZYMO EZ DNA Methylation-GoldTMKit(The Epigenetics companyTM)；Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2X)(Thermo Scientific)；Zymo TaqTMPremix(Epigenetics companyTM)；RNase-Free ddH2O(Thermo Scientific)。

1.3 組織樣核酸提取

1.3.1 組織總RNA提取及cDNA合成 利用TRIzol法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA樣品質量和濃度(吸光度OD260/280)，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗其完整性，置于-80 ℃保存備用。將提取的總RNA稀釋成200 ng/μL，分別取5 μL，反轉錄獲得cDNA，-20 ℃保存備用。

1.3.2 基因組DNA提取與重亞硫酸氫鹽處理 利用DNA提取試劑盒提取麥洼牦牛、類烏齊牦牛各組織基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA樣品的質量和濃度(吸光度OD260/280)，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-80 ℃保存備用。嚴格按照DNA甲基化試劑盒說明書對基因組DNA 20 μL(DNA質量為200 ～ 500 ng最適宜，不足20 μL應加ddH2O補齊)進行重亞硫酸氫鹽處理，-20 ℃保存備用。

1.4 引物設計與合成

根據西南民族大學青藏高原研究院動物遺傳育種與繁殖實驗室已有的牦牛ACTA1基因CDS區序列設計熒光定量引物ACTA1-qPCR，以β-actin作為內參基因。根據ACTA1基因序列(GenBank： AC_000185)設計啟動子區PCR引物ACTA1-PCR，引物具體信息見表1。引物由Thermo(上海)公司合成。

表1 ACTA1-PCR引物

1.5 ACTA1基因啟動子區克隆、序列分析

以基因組DNA為模板，以ACTA1-PCR為引物進行ACTA1基因啟動子區擴增(25 μL體系)。凝膠電泳檢測擴增結果，試劑盒純化PCR陽性擴增產物。取1 μL膠回收產物與PUC載體pMD-19T于16 ℃過夜連接，然后轉化至DH5α感受態細胞，并涂布于Ampr/LB固體培養基平板；挑取單個菌落接種于含Ampr/LB液體培養基中。經PCR鑒定后，將陽性重組質粒送擎科生物技術公司(成都)測序。

啟動子區克隆測序結果經NCBI-Blast比對后，從NCBI數據庫搜集12個物種ACTA1基因啟動子區序列，利用MEGA 7.0軟件構建不同物種間ACTA1基因啟動子區核苷酸序列進化樹。在線軟件Methprimer(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi預測CPG島(圖1)。選擇長度為230 bp的 CpG1(-202～-431 bp、包含16個CG位點)作為研究對象，并篩選ACTA1基因BSP引物ACTA1-P1(圖2)。如圖2所示，第一排為目的基因原序列，第二排為重亞硫酸氫鹽轉化后的序列，除CG位點外的C均轉化為T，P1-F/R為BSP引物。

圖1 ACTA1基因啟動子區CpG島預測

1.6 重亞硫酸鹽測序及分析

取重亞硫酸鹽處理后的DNA作為模板進行BSP反應，PCR反應體系(10 μL)：Zymo TaqTMPremix 25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板4 μL，ddH2O 19 μL。反應程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，最佳Tm 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 7 min。將PCR產物連接到載體PMD19-T，并轉化至DH5α感受態細胞，從平板上挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，每個轉化板挑取至少10個陽性克隆，送擎科(成都)生物技術公司測序。使用Bio Analyzer 軟件分析測序結果；利用在線軟件MSR calculate(http://www.msrcall.com/ MSRcalcalate.aspx)繪制ACTA1基因甲基化位點棒棒糖模型。

圖2 ACTA1基因啟動子區序列及BSP擴增區域示意圖

1.7 qRT-PCR定量分析類烏齊牦牛、麥洼牦牛ACTA1 mRNA表達

實時熒光定量 PCR以β-actin為內參基因，對類烏齊牦牛、麥洼牦牛ACTA1基因mRNA在臀大肌、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脂肪6個組織中的表達水平進行定量檢測。反應體系(10 μL)：SYBR premix Dimer Eraser(2x)5 μL，ddH2O 3.2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，cDNA 1 μL。反應程序： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，39個循環；添加熔解曲線。設置以ddH2O為模板的陰性對照，每個組織進行3個技術重復，使用Bio-Rad 公司熒光定量PCR儀進行定量分析。

1.8 數據分析與處理

采用2-ΔΔCt法對ACTA1基因mRNA表達水平進行相對定量分析，所得數據用SPSS 19.0軟件進行分析，ACTA1基因mRNA相對表達豐度采用ANOVA方差分析和Turkey′s LSD檢驗，所有結果當P<0.05時，具有統計學意義。最后使用GraphPad Prism 5繪制ACTA1基因在類烏齊牦牛、麥洼牦牛不同組織的mRNA表達柱狀圖；甲基化程度和mRNA相對表達量的所有數據均采用“平均值±標準誤差(mean±SEM)”表示。

2 結果與分析

2.1 ACTA1基因序列分析

經克隆及測序獲得牦牛ACTA1基因轉錄起始位點上游及第一外顯子區域部分序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3-A所示，總長為1 028 bp，經NCBI-Blast分析，與黃牛序列一致性為99.7%，其中A、T、G、C殘基含量分別為19.4%(199)，17.5%(180)，30.9%(318)，32.2%(331)，A+T的含量(36.9%)小于G+C(63.1%)。以重亞硫酸鹽處理后的DNA作為模板進行ACTA1啟動子區，CpG1 BSP克隆及測序，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3-B所示。

M.DL2000分子質量標記； A(1-12).ACTA1基因啟動子PCR擴增； B(1-12).ACTA1基因CpG1 PCR擴增。

2.2 系統發育樹構建

以NJ法構建ACTA1基因啟動子區系統發育樹，結果顯示，牦牛與黃牛聚為一支，親緣關系最近；水牛、綿羊、豬及犬各單獨占據一支，與牦牛親緣關系較近；兩棲綱的熱帶爪蟾與牦牛親緣關系最遠，說明哺乳動物ACTA1基因在長期生物進化過程中高度保守(圖4)。

2.3 CpG島甲基化水平分析

利用在線軟件MSR Calcalate繪制各組織甲基化狀態的棒棒糖模型(圖5)。圖示每行代表一個陽性克隆測序和比對后的甲基化狀態，其中白色圓圈表示未被甲基化的CG位點，黑色圓圈表示被甲基化修飾的CG位點。結果顯示，ACTA1啟動子區CpG島在成年類烏齊牦牛和麥洼牦牛各組織中均表現為較低的甲基化狀態，且除肺臟組織外，其他各組織甲基化水平無顯著差異(P>0.05)，類烏齊牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟和脂肪的甲基化概率分別為6.25%，6.88%，20.00%，16.25%，26.25%，29.38%，麥洼牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟和脂肪的甲基化概率分別為5.00%，7.50%，18.13%，20.00%，26.25%，28.75%(表2)；，其中臀大肌的甲基化水平最低，脂肪組織的甲基化水平最高。統計分析發現，第3，4，11，13位CG位點甲基化頻率分別為34.17%，42.50%，35.83%，35.83%，遠高于其他CG位點。

圖4 ACTA1基因啟動子序列系統發育樹

A-F.類烏齊牦牛不同組織(臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪)； G-L.麥洼牦牛不同組織(臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪)。

2.4 qRT-PCR定量分析牦牛ACTA1 mRNA表達

熒光定量PCR結果顯示，ACTA1基因在類烏齊牦牛、麥洼牦牛各組織中均有表達，表達量存在一定差異。由表2可知，2個群體在臀大肌均呈現最高表達，顯著高于其他組織表達量(P<0.05)；其次在心臟的表達量較高，顯著高于腎臟、肺臟、肝臟、脂肪組織表達量(P<0.05)；而在腎臟、肺臟、肝臟、脂肪組織中的表達量依次降低，其中肺臟與腎臟和肝臟差異不顯著(P>0.05)，但三者均顯著高于脂肪(P<0.05)。相對表達量與DNA甲基化相關性分析發現，ACTA1基因各組織表達量與DNA甲基化水平顯著負相關(r=-0.797，P=0.002)(表2)。

表2 ACTA1基因在麥洼牦牛和類烏齊牦牛各組織的相對表達量及其CpG島甲基化程度

注：**表示在0.01水平(雙側)上顯著相關(P<0.01)。相同字母代表無顯著差異(P>0.05)；相異字母代表差異顯著(P<0.05)。

Note：**Indicates significant correlation at the 0.01 level (both sides) (P<0.01). Identical letters represent no significant differences (P>0.05); Distinct letters represent significant differences (P<0.05).

3 結論與討論

在動物生長發育過程中，DNA甲基化修飾對基因表達發揮重要作用[15]。最初，DNA甲基化在動物育種工作中的研究主要集中在雜交育種[16-17]、雄性不育[18-20]、胚胎移植[21-22]以及泌乳性能等方面[23]，近幾年，出現了少量有關DNA甲基化影響肌肉發育、脂肪沉積的研究報道。韓玉嬌[24]發現 6月齡秦川牛肌肉和脂肪組織中甲基化水平顯著低于24月齡秦川牛肌肉和脂肪組織中甲基化水平(P<0.01)，且甲基化水平與 mRNA表達水平呈負相關。房希碧[25]利用全基因組甲基化測序法和轉錄組測序法聯合分析發現，日本和牛與草原紅牛背最長肌的147個基因DMRs甲基化水平與基因表達水平呈負相關，其中大部分基因可能通過 DNA 甲基化調控基因的表達水平，從而影響肉質性狀。姚力丹等[26]分析5月齡巴什拜羊肌肉組織MSTN基因DNA甲基化和mRNA表達量的關系，發現MSTN基因DNA甲基化與其表達量呈負相關。上述研究均證實了基因啟動子區域CpG島的甲基化程度與該基因的表達水平呈負相關[13]。DNA甲基化具有組織特異性、時間和空間特異性，即使同一個體在不同時期不同組織DNA甲基化狀態可能會相差迥異[27]。本研究在前期克隆了ACTA1基因編碼區及啟動子區的基礎上，檢測了各組織ACTA1mRNA在類烏齊牦牛和麥洼牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪各組織間表達水平差異，并利用重亞硫酸氫鹽測序法分析了各組織器官DNA甲基化水平，試圖尋找ACTA1基因甲基化模式與mRNA表達量間的聯系，為牦牛的表觀遺傳領域提供一定的數據支持。

相關研究證明，哺乳動物體內的組織特異性基因CpG島通常呈現較低的甲基化狀態，其甲基化的CG位點往往為隨機分布，CpG島區域DNA甲基化修飾程度與mRNA表達量呈負相關[28]，本研究結果顯示，ACTA1啟動子區CpG島在牦牛的各個組織中甲基化的CG位點隨機分布，且均表現為較低的甲基化水平。其中ACTA1基因在脂肪組織DNA甲基化水平最高，肌肉組織最低，其中類烏齊牦牛甲基化水平依次為：臀大肌<心臟<腎臟<肺臟<肝臟<脂肪，而麥洼牦牛甲基化水平依次為：臀大肌<心臟<肺臟<腎臟<肝臟<脂肪。ACTA1基因mRNA表達水平定量分析顯示在6個組織中均有表達，其中類烏齊牦牛和麥洼牦牛在臀大肌和心臟組織中的表達量均最高，在脂肪的表達量均最低，其表達量趨勢均為：臀大肌>心臟>腎臟(肺臟)>肝臟>脂肪。牦牛常年生活在平均海拔3 500 m以上的高寒草甸草場，飼養方式以自然放牧為主，牦牛善走陡坡險路、雪山沼澤、能渡江河等，其骨骼肌為適應高強度運動及代謝需求，臀大肌等骨骼肌肌纖維含量非常豐富且發達，因此，ACTA1mRNA表達量極顯著高于其他組織器官。此外，牦牛心臟ACTA1mRNA表達量顯著高于其他組織，肌纖維含量豐富，有利于氧氣運輸及氣體交換，在氧含量極低的高原環境也可為機體代謝活動供應充足的氧氣。利用SPSS 19.0分析各組織ACTA1mRNA表達量與DNA甲基化水平相關性極顯著性，結果顯示，各組織表達量與DNA甲基化水平存在顯著負相關(r=-0.796，P<0.01)，表明ACTA1基因啟動子區甲基化組織特異性較強。各組織DNA甲基化模式在類烏齊牦牛與麥洼牦牛間無顯著差異，推測是因為ACTA1基因在長期生物進化過程中高度保守，故其甲基化率在同一物種不同品種間無顯著差異，相關推測有待進一步驗證。ACTA1基因啟動子區CpG島區域具有一定的轉錄活性，且各組織間甲基化水平與組織特異性表達存在顯著負相關，2個品種間各組織甲基化水平無顯著差異，證明啟動子區域DNA甲基化對肌肉發育具有一定的調控作用，但影響基因表達的因素很多，可能還會涉及染色質重塑、非編碼RNA、蛋白質修飾等其他調控方式，因此，本研究結果僅可在表觀遺傳領域為牦牛遺傳育種提供部分數據支持。

本試驗成功克隆了ACTA1基因啟動子區并構建了13個物種間系統發育樹，發現牦牛與黃牛、羊的親緣關系最近，證明ACTA1基因在長期生物進化過程中高度保守；對ACTA1基因啟動子區CpG1進行DNA甲基化差異分析和mRNA表達水平檢測，結果發現，ACTA1基因DNA甲基化與其表達量呈顯著負相關，臀大肌甲基化水平低于其他組織，其ACTA1mRNA表達量顯著高于其他組織，脂肪組織與之相反，表明DNA甲基化對肌肉和脂肪發育具有一定的調控作用，可作為牦牛遺傳育種的表觀遺傳標記的參考。