蒙藥白花龍膽花總黃酮提取工藝及醇提物的抗炎活性研究

嘎 魯，格根塔娜，盛 華，王玉華

（內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010011）

白花龍膽花為龍膽科植物高山龍膽（gentiana purdomii Marq.）的干燥花，蒙語名為查干—珠勒根—其木格，別名有邦占嘎日布，那木日音—其其格，查干—邦占（通稱）。按花的顏色可分為白、黑、花3種，但白色者為上品[1-2]，主要分布于西藏、青海、新疆、甘肅、四川等地，其味澀、苦，性寒；效軟、柔、稀。具有清熱解毒，止咳，利咽喉作用，蒙醫臨床上主要用于治咽喉腫痛，音啞，肺熱，毒熱等。蒙醫藥古籍《蒙藥驗方》中記載查干—珠勒根—其木格在對咽喉病癥特效的蒙藥復方呼和嘎日迪-13等中均有應用[3]，主要含龍膽堿等生物堿，異葒草素等黃酮類化合物[4-8]。本項目對白花龍膽花總黃酮提取工藝和醇提物體內抗炎活性進行研究，現報道如下。

1 材料與儀器

1.1 動物 昆明種小鼠（雌雄兼用，19～27 g），由內蒙古大學實驗動物中心提供。

1.2 藥材及藥物 白花龍膽花采自青海省，阿司匹林（石藥集團）、二丁顆粒（修正藥業）。

1.3 試劑 乙醇（分析純）、蒸餾水、生理鹽水；蘆丁標準品（Y-132-150801，含量：98.0%，中國食品藥品檢定研究院）。

1.4 儀器 分析天平、旋轉蒸發儀、超聲提取儀、高壓滅菌鍋、冷凍干燥機、紫外分光光度計。

2 白花龍膽花總黃酮提取工藝試驗

2.1 標準品溶液的制備 精密稱取蘆丁標準品11.55 mg，用乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，搖勻，得濃度為0.23 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

2.2 線性關系的考察 分別取標準品溶液0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL于6個25 mL容量瓶中，以乙醇溶液作為空白對照，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，靜止5 min；加10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜止6 min；加40%氫氧化鈉溶液0.5 mL，用乙醇定容，搖勻。在510 nm波長處分別檢測吸光度，以標準品溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸，得蘆丁溶液在0.005 6～0.023 0 mg/mL濃度范圍之內線性關系良好。

2.3 單因素實驗

2.3.1 乙醇濃度對白花龍膽花總黃酮含量的影響 精密稱取白花龍膽花粉末5份，每份約1 g，25℃超聲提取2次，提取儀功率220 W，液料比1:30，超聲時間30 min，提取溶劑分別為40%、55%、70%、80%、95%乙醇，測定波長為510 nm 處吸光度，40%濃度提取物黏度過高，無法過濾，剩余4組吸光度（A）分別為0.863、0.920、0.841、0.744，總黃酮含量分別為3.02%、3.23%、2.96%、2.62%，選擇55%、70%、80%乙醇作為正交試驗考察因素。

2.3.2 料液比對白花龍膽花總黃酮含量的影響 精密稱取白花龍膽花粉末5份，每份約1 g，25 ℃超聲提取2次，提取儀功率220 W，溶劑為70%乙醇，超聲時間30 min，料液比分別為1:10，1:20，1:30，1:40，1:50，測定波長為510 nm 處吸光度（A），分別為0.877、0.984、0.912、0.822、0.845，總黃酮含量分別為5.40%、6.06%、5.63%、4.99%、5.21%，選擇料液比1:10、1:20、1:30作為正交試驗考察因素。

2.3.3 提取時間對白花龍膽花總黃酮含量的影響 精密稱取白花龍膽花粉末5份，每份約1 g，25℃超聲提取2次，提取儀功率220 W，溶劑為70%乙醇，料液比為1:20，超聲提取時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，測定510 nm 處吸光度（A），分別為0.488、0.433、0.590、0.523、0.533,總黃酮含量分別為2.49%、2.21%、3.02%、2.67%、2.72%，選擇超聲提取時間20 min、30 min、40 min作為正交試驗考察因素。

2.4 正交試驗 黃酮類化合物是白花龍膽花中的主要有效成分之一，多數均有抗炎抗菌等生物活性，黃酮類化合物分子顯弱極性，易溶于乙醇中。根據單因素試驗結果，選擇乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為3個考察因素，每個因素設置3個水平，利用L9（3）4正交表做正交試驗。見表1。

表1 正交試驗因素及水平

精密稱取白花龍膽花粉末9份，每份約1 g，加溶劑，搖勻，超聲提取2次，過濾，合并濾液，旋除溶劑，將得到的棕黃色浸膏用乙醇定容至25 mL容量瓶中，每一因素水平試驗平行操作3次，確保其重現性。正交試驗設計及結果，見表2。

3 體內抗炎活性實驗

3.1 白花龍膽花醇提物的制備 白花龍膽花干燥藥材200 g，粉粹，用試驗2.4中得到的最佳工藝條件提取2次，合并濾液，濃縮，冷凍干燥得到干燥粉54.2 g，提取率為27.1%。

3.2 急性毒性實驗 將50只小鼠（雌雄兼有）隨機分5組，每組10只，對其進行急性毒性實驗，并利用SPSS 20.0軟件對數據進行計算，得LD50的估計值為18.727 g/kg；95%的置信區間為（15.875，22.528）。

表2 正交試驗設計及含量測定結果

3.3 小鼠肉芽腫實驗 將濾紙裁剪為0.02 g，置于燒杯中，高壓滅菌備用；將60只小鼠隨機分6組（雌雄兼有），每組10只，分別是模型組、阿司匹林組、二丁顆粒組、試驗藥物低劑量組、試驗藥物中劑量組、試驗藥物高劑量組，稱重，乙醚麻醉，左腹溝處消毒，切開皮膚，埋入滅菌濾紙，縫合；根據體重灌胃（0.8 mL/20 g），模型組用生理鹽水，阿司匹林0.208 mg/10 g，二丁顆粒78 mg/10 g，試驗藥物低劑量11.7 mg/10 g，試驗藥物中劑量23.4 mg/10 g，試驗藥物高劑量46.8 mg/10 g。觀察小鼠外觀、行為、死亡情況；連續給藥9 d后無死亡，第10 d根據小鼠體重用10%水合氯醛麻醉后取出濾紙，80 ℃恒溫干燥24 h，稱紙片重量，計算肉芽腫脹度和肉芽腫脹抑制率。利用軟件SPSS 20.00處理實驗數據，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認為差異具有統計學意義。見表3。

表3 各實驗組小鼠肉芽腫脹度比較（±s，n=10）

表3 各實驗組小鼠肉芽腫脹度比較（±s，n=10）

3.4 小鼠耳腫脹實驗 將60只小鼠（雌雄兼有）隨機分6組，每組10只，分別是模型組、阿司匹林組、二丁顆粒組、試驗藥物低劑量組、試驗藥物中劑量組、試驗藥物高劑量組，稱重，根據體質量灌胃，模型組用生理鹽水，阿司匹林0.208 mg/10 g，二丁顆粒78 mg/10 g，試驗藥物低劑量11.7 mg/10 g，試驗藥物中劑量23.4 mg/10 g，試驗藥物高劑量46.8 mg/10 g。觀察小鼠外觀、行為、死亡情況；連續給藥5 d后，于末次給藥后30 min后右耳兩面涂抹二甲苯20 μL致炎，左耳不涂做對照，1 h后處死，剪下兩耳，用打孔器在兩耳相同部位取片，稱重，計算腫脹度，腫脹抑制率。數據利用SPSS 20.00軟件進行統計學處理，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認為差異具有統計學意義。見表4。

表4 各實驗組小鼠耳腫脹度比較（±s，n=10）

表4 各實驗組小鼠耳腫脹度比較（±s，n=10）

3.5 以白花龍膽花總黃酮提取量為指標，對結果進行方差分析 結果表明，各因素對白花龍膽花中總黃酮的提取影響的順序是B＞A＞C，（即料液比＞乙醇濃度＞提取時間）。因素A和B與各因素之間具有顯著性差異（P＜0.05），即乙醇濃度和料液比對白花龍膽花總黃酮提取量具有顯著性影響。因素C與各因素間差異無統計學意義（P＞0.05），即提取時間對白花龍膽花總黃酮提取量無顯著影響。見表5。

表5 方差分析結果

4 討論

黃酮類化合物是一類存在于自然界的，具有2-苯基色原酮結構的化合物，廣泛存在于植物藥物中，也是植物類藥物的主要有效成分之一。目前從植物藥物中提取黃酮類化合物方法有加熱回流法、超聲法、微波法等9種方法[9-10]。本研究中根據前期的預實驗和參考文獻選擇乙醇加熱回流法提取白花龍膽花中的黃酮類化合物，并通過單因素試驗，選擇乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為3個考察因素，每個因素設置3個水平，進行正交提取試驗[11-12]，初步確定蒙藥白花龍膽花中提取黃酮類化合物的最佳工藝為 70%乙醇，料液比1:30，超聲提取時間20 min，即A2B3C1。

與模型組比較，阿司匹林組、二丁顆粒組、試驗藥物中劑量組和高劑量組小鼠肉芽腫脹度顯著性降低，均有統計學意義（P＜0.05），試驗藥物低劑量組小鼠肉芽腫脹度無顯著性降低，無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，阿司匹林組、二丁顆粒組、試驗藥物低劑量組、試驗藥物中劑量組和試驗藥物高劑量組小鼠耳腫脹度顯著性降低，均具有統計學意義（P＜0.05）。耳腫脹實驗是將致炎物質二甲苯涂抹于小鼠耳廓，增加其耳廓毛細血管通透性，導致增加滲入組織的液體，形成炎癥[13]，是一種常用炎癥模型。本研究中根據白花龍膽花在蒙醫復方中的實際應用量和急性毒性實驗結果，將白花龍膽花醇提物凍干粉分別按11.7 mg/10 g，23.4 mg/10 g和46.8 mg/10 g的3種不同劑量給予耳腫脹炎癥模型小鼠。結果顯示，23.4 mg/10 g，和46.8 mg/10 g 劑量組具有明顯降低模型小鼠耳腫脹度。肉芽腫（增殖相）實驗是棉球、海綿、玻璃棒、濾紙等埋入動物局部皮下，可產生與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽增生[14-16]。本研究中分別按11.7 mg/10 g，23.4 mg/10 g和46.8 mg/10 g的3種不同劑量將白花龍膽花醇提物凍干粉給予肉芽腫模型小鼠（埋入濾紙）。結果顯示，23.4 mg/10 g，和46.8 mg/10 g 劑量組均具有明顯抑制肉芽腫脹度作用。從以上實驗結果初步得知，一定濃度的白花龍膽花醇提物具有明顯抗炎活性[17-20]。