遼西北風沙區不同人工林土壤真菌群落結構及功能特征

鄧嬌嬌，朱文旭，張 巖，殷 有，周永斌＊

(1. 沈陽農業大學林學院，遼寧 沈陽 110161；2. 中國森林生態系統監測網絡遼寧遼河平原森林生態系統定位研究站，遼寧 昌圖 112500)

遼西北風沙區是典型的生態脆弱區，位于我國科爾沁沙地南緣，該區水資源不足，氣候干燥，植被覆蓋率低，大風頻繁，是三北防護林體系建設工程的重點治理區域。自20世紀50年代以來，我國一直在實施大規模沙漠化治理工程[1]，進行大面積人工造林[2]。1978年以來，我國啟動了世界上最大的造林項目“三北防護林帶發展計劃”[3]。近四十年來，該地區營造了大面積防護林，在生態修復中起著重要的作用。防護林體系的構建是改善沙區生態環境的有效措施，不僅有助于減輕風沙危害[4]，防止土壤退化，而且防護林種植有助于改良土壤，增加土壤有機質含量[5]，從而影響土壤微生物的活性。

土壤微生物是陸地生態系統的重要生物驅動力之一[6]，是土壤生物地球化學循環中最核心的部分[7]，是控制生態系統中C、N和其他養分流的關鍵[8]，在推動土壤生態系統的平衡穩定發展方面發揮著至關重要的作用[9]。而且，土壤微生物也是最敏感的指標之一[10-12]，較土壤理化特性更能反映土壤質量。諸多研究表明，植被類型、土壤特性以及土壤微生物具有一定的相關性[13-14]，土壤理化性質及養分含量的改變會顯著影響微生物群落功能多樣性[15-16]，土壤微生物在提高土壤氮、磷、鉀，改善土壤質量等方面也具有重要作用[17]。微生物多樣性較高表明土壤養分補充性能較好，且微生物對底物的利用率高[18]。其中，土壤真菌是土壤中的主要分解者之一，能夠分解土壤中的有機物(植物殘體)，為植物提供養分[19]，部分真菌有助于提高植物的抗逆性，維持植物正常生長。同時，土壤真菌在促進土壤穩固、團聚體的形成以及改善土壤結構方面具有重要作用[20]，對土壤環境乃至整個生態系統都會產生重要影響。在生態系統恢復過程中，真菌群落的變化是一個關鍵性指標[21]，不同樹種土壤真菌數量和群落結構具有顯著差異[19，22]。除真菌群落多樣性和結構之外，微生物功能也是反映土壤質量的重要因子。其中，FUNGuild軟件的開發利用有助于我們更好地研究真菌功能類群，且已被眾多的學者用于真菌功能群的研究[23-24]。

目前，針對遼西北風沙區防護林的研究主要集中在不同防護林土壤C、N、P垂直分布特征[25]，土壤水穩性團聚體質量分數和有機質質量分數方面[26]，而針對該地區不同防護林土壤真菌的多樣性及功能尚無系統報道。因此，本研究以遼寧省西北部的昌圖縣付家林場典型的人工防護林，樟子松人工林(Pinus sylvestris var. mongolica Litv.)、油松人工林(P. tabuliformis Carrière)、楊樹人工林(Populus ×canadensis Moench)為研究對象，探討不同人工防護林下土壤真菌群落結構和功能特征，以期為該地區植被恢復和人工林固沙造林樹種的選擇提供參考。

1 研究區概況

試驗地位于遼寧鐵嶺市昌圖縣付家林場，地處科爾沁沙地東南邊緣，位于遼寧、內蒙古、吉林三省區交匯處，地勢平坦，地貌屬遼河沖積平原兼有少量沙丘。土壤類型大部分為風沙土。該地屬溫帶半濕潤半干旱大陸性季風氣候，最高氣溫為35.6 ℃，最低氣溫為-31.5 ℃，降雨集中在7—8月，年平均降水量400～550 mm，年蒸發量1 843 mm，遠高于年降水量，極度干旱。該地區的原有植被為少量的灌木和草本，現植被以樟子松和楊樹等形成的防風固沙林為主(表1)。

表 1 樣地信息Table 1 Sampling site information

2 研究方法

2.1 土壤樣品的采集與處理

2018年7月，分別在試驗區選擇楊樹人工林、樟子松人工林和油松人工林3塊樣地。分別在每個樣地中設置3塊20 m×20 m樣方，每個樣方間距100 m以上，去除表層石塊和落葉等雜物，在每個樣方內采用“S”形多點取樣，利用土鉆在樹木周圍采集0～10 cm土層樣品，將土壤樣品混勻，作為1個重復，每個處理3個重復，共9個土壤樣品，放入無菌自封袋內，做好標記，放入冰盒帶回實驗室。去除土壤樣品中的植物殘根、石礫等雜物，研碎混勻，過2 mm篩。一部分土壤樣品風干后用于土壤化學性質的測定，一部分土壤樣品于4 ℃保存，用于可溶性有機碳的測定，另一部分于-80 ℃冰箱內進行冷藏保存，用于分子生物學的測定分析(3個樣地的3個樣方的樣品均作為一個獨立樣品進行高通量測序)。

2.2 土壤化學性質的測定

pH值采用2.5∶1的水土比，用pH計(TP310)進行測定；土壤全氮含量采用元素分析儀(Elementar, Germany)進行測定；土壤可溶性有機碳含量采用碳氮元素分析儀(TOC，Multi N/C 3100，Analytik Jena AG Multi N/C 3100，Analytik Jena AG)進行測定；速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定。

2.3 土壤DNA提取和高通量測序

土壤總DNA提取采用美國OMEGA公司的MoBio PowerSoil? DNA Isolation Kit (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)試劑盒，每個樣品稱取約0.5 g新鮮土壤，按照試劑盒提取步驟進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量(純度和完整性)，用核酸定量儀NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA，USA)檢測DNA提取物的濃度和純度。用引物ITS1F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2 (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進行真菌ITS區擴增。PCR擴增體系共25 μL，包含：DNA 模板 2 μL，各 1 μL 上下游引物 (10 μmol·L-1)，緩沖液 5 μL，Q5 高保真緩沖液 5 μL，0.25 μL 高保真 DNA 聚合酶 (5 U·μL-1)，dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL，超純水 (dd H2O) 8.75 μL。PCR 擴增條件為：98 ℃ 預變性2 min，然后98 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環，最后，72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，回收采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒，產物送上海派森諾生物科技有限公司，采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit (Illumina公司)制備測序文庫。

2.4 真菌功能預測

將QIIME輸出的OUT表和物種信息表合并，上傳到FUNGuild網站，進行比對和解析真菌群落的營養型、功能分組。依據營養方式劃分到病理營養型(pathotroph)、共生營養型(symbiotroph)和降解營養型(saprotroph)3個營養方式以及12個Guild類中，據此進行真菌生態功能群分析。

2.5 統計分析

通過使用QIIME軟件對原始下機序列進行過濾、拼接、去除嵌合體[27]，并對序列長度進行篩選。然后，將有效數據進行OTU歸類，對OTUs進行群落豐富度指數和群落均勻度指數分析，包括Chao1指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數。不同人工林土壤特性、真菌多樣性指數和真菌群落組成差異比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，不同處理間的差異顯著性校驗采用最小顯著性差異法LSD(Least-Significant Difference)法。使用 RStudio v3.5.1 軟件中的“gplot”和“pheatmap”來構建評價土壤真菌群落間多樣性與土壤理化性質的相關性熱圖。使用RStudio v3.5.1軟件中的“vegan”對相對豐度為前50的真菌屬以及不同真菌功能類群進行聚類分析并繪制熱圖。采用Unweighted UniFrac距離來分析不同土壤樣品間真菌群落結構的差異，并通過非度量多維尺度(NMDS)進行可視化。采用Canoco 4.5中的典型相關分析(CCA)來研究土壤環境因子與土壤真菌群落功能類群的相關性。

3 結果與分析

3.1 不同人工林土壤特性

通過測定，發現昌圖縣付家林場不同類型人工林的土壤化學性質差異顯著(見表2)，楊樹人工林土壤pH值為5.92，顯著高于油松和樟子松人工林(P＜0.05)；楊樹人工林土壤可溶性有機碳和速效磷的含量分別為 105.46 g·kg-1和 16.00 g·kg-1，均顯著高于樟子松和油松人工林(P＜0.05)，樟子松人工林下土壤的全氮含量最高，為1.05 g·kg-1，顯著高于楊樹和油松人工林(P＜0.05)，楊樹人工林土壤C/N為9.15，顯著低于樟子松和油松人工林(P＜0.01)。通過比較，發現楊樹人工林能顯著增加土壤pH、土壤可溶性有機碳和速效磷的含量，降低土壤C/N。

表 2 不同人工林土壤特性Table 2 Soil properties for different plantation forests

3.2 不同人工林土壤真菌多樣性特性

通過對9個樣地的土壤樣品DNA測序分析，以97%相似性閥值進行OTU聚類，獲得真菌群落結構組成信息。真菌測序深度(Coverage)為97%，與數據庫進行比對后可知，真菌包括15個門、54個綱和513個屬。測序結果經去除嵌合體和低質量的序列后，從所有樣品中共得到真菌ITS序列494，675條，平均每個土壤樣品有54 963條序列，平均長度為330 bp。為了確定樣品的稀疏曲線，從每個樣本中隨機選擇21 490個reads，在3%差異水平下，隨著實測序列數量的增加，曲線趨于平坦，表明本試驗獲得了大部分樣本信息，能夠反映不同人工林土壤真菌群落組成(圖1)。當序列相似度為97%時，在真菌門水平上，樟子松人工林、油松人工林和楊樹人工林分別有579、464和708個 OTU(表 3)。基于 Unweighted UniFrac距離的NMDS分析結果，發現樟子松人工林和油松人工林土壤真菌群落結構具有較大的相似性，都位于NMDS1軸的負半軸，而楊樹人工林真菌群落位于NMDS1軸的正半軸，與樟子松和油松人工林土壤真菌群落明顯沿NMDS1軸分開(圖2)。

通過分析發現，付家林場不同人工林土壤真菌群落多樣性指數存在顯著差異，楊樹人工林土壤真菌的Simpson指數、Chao1指數和ACE指數分別為0.980、905.96和931.47，都顯著高于其他(P ＜0.05)；油松人工林最低，分別為0.942、472.46和471.26。不同人工林土壤真菌的Shannon指數無顯著差異 (表 3)。土壤 pH值與 ACE指數 (r =0.81，P ＜ 0.01)和Chao1 指數(r = 0.81，P ＜ 0.01)呈極顯著正相關；土壤DOC與土壤真菌Simpson指數 (r = 0.86，P ＜ 0.01)，ACE 指數 (r = 0.79，P ＜ 0.05)和Chao1指數(r = 0.78，P ＜ 0.05)呈顯著正相關。土壤AP與土壤真菌ACE指數(r = 0.86，P ＜ 0.01)和Chao1指數(r = 0.86，P ＜ 0.01)呈極顯著正相關，土壤C/N與土壤真菌Simpson指數(r = -0.80，P＜0.01)，ACE(r = -0.91，P＜0.01)和 Chao1 指數(r = -0.91，P ＜ 0.01)呈極顯著負相關 (圖 3)。

圖 1 3個真菌群落高通量測序的ITS rDNA稀疏曲線Fig. 1 Rarefaction curves of ITS rDNA for high throughput sequencing of three fungal communities

3.3 不同人工林土壤真菌群落結構特征

研究發現，付家林場不同樣地土壤真菌群落組成存在差異，根據真菌的高級分類可知[28]，所得序列屬于14門(不包括unidentified)，優勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，它們的相對豐度分別為49.58% ～ 59.56%和23.99% ～29.77%。其他相對豐度占1%以上的門分別為被孢霉門(Mortierellomycota) (3.89%)、油壺菌門（Olpidiomycota)(1.28%)和壺菌門(Chytridiomycota)(1.21%)。油松人工林中子囊菌門的相對豐度最高，而油松人工林土壤中擔子菌門、被孢霉門和壺菌門的相對豐度均最低(圖4)。

在綱水平上，平均相對豐度大于1%的綱共有9個，分別為座囊菌綱(Dothideomycetes)(13.86%～20.68%)、傘菌綱(Agaricomycetes)(12.83%～22.28%)、糞殼菌綱(Sordariomycetes) (6.38%～23.09%)、散囊菌 綱 (Eurotiomycetes) (0.26%～23.80%)、 銀 耳 綱(Tremellomycetes)(5.93%～13.55%)、錘舌菌綱(Leotiomycetes) (5.44% ～6.68%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes) (2.13%～4.83%)、盤菌綱(Pezizomycetes)(0.22%～7.06%)和GS18 (0.17% ～2.58%)。其中，座囊菌綱、傘菌綱、錘舌菌綱、被孢霉綱和盤菌綱的相對豐度在不同人工林樣地中無顯著差異。在楊樹人工林土壤中糞殼菌綱和銀耳綱的相對豐度最高，且顯著高于其他人工林樣地(P＜0.05)，然而，在油松人工林土壤中散囊菌綱相對豐度含量最高，顯著高于其他樣地 (P＜0.05) (圖 5)。

在所有的樣品中共檢測出513個屬，其中，相對豐度大于1%的主要的真菌類群為Guehomyces(3.96%)、被孢霉屬(Mortierella) (3.88%)、青霉菌屬 (Penicillium) (3.31%)、Plectosphaerella (2.52%)、小 皮 傘 屬 (Marasmius) (2.50%)、 Knufia (2.33%)、Phallus (2.31%)、Devriesia (1.54%)、紅菇屬(Russula)(1.48%)，Trechispora (1.37%)、Microidium (1.35%)、Lectera (1.17%)和籃狀菌屬(Talaromyces)(1.10%)(圖6)。相對豐度前50的真菌屬的熱圖分析表明，不同植被類型的真菌群落結構不同，可以劃分為兩個類群，其中樟子松人工林和油松人工林為一類，楊樹人工林為單獨一類(圖7)。

表 3 不同人工林土壤真菌多樣性指數Table 3 Soil fungal diversity index in different plantation forests

圖 2 不同人工林土壤真菌群落非度量多維尺度分析Fig. 2 Non-metric multidimensional scaling (NMDS)analysis based on Unweighted UniFrac distance under different plantation forests

圖 3 土壤特性與微生物多樣性間的相關性Fig. 3 The relationships between soil characteristics and soil fungal community diversity

圖 4 不同人工林土壤優勢真菌門的相對豐度Fig. 4 The relative abundances of dominant fungal communities at phylum level

圖 5 不同人工林優勢真菌綱相對豐度Fig. 5 The relative abundances of dominant fungal communities at class level

圖 6 不同人工林土壤真菌屬水平相對豐度Fig. 6 The relative abundances of fungal communities at genus level

3.4 不同人工林土壤真菌群落功能比較

真菌的生態功能類群是基于營養型來劃分的。根據FUNGuild數據庫的比對結果，對3種人工林真菌的營養型(trophic mode)進行分類統計，結果如圖3所示，檢測到8個營養型(Trophic mode)，分別為致病菌-腐生-共生營養型(Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph)、病理營養型(Pathotroph)、病理-腐生營養型(Pathotroph-Saprotroph)、病理-腐生-共生營養型 (Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph)、病理-共生營養型(Pathotroph-Symbiotroph)、腐生營養型(Saprotroph)、腐生-共生營養型(Saprotroph-Symbiotroph)和共生營養型(Symbiotroph)。該區3種人工林土壤真菌主要以腐生營養型為主，腐生-共生營養型次之。對不同人工林土壤真菌功能類群進行聚類分析結果表明，不同人工林真菌群落功能可劃分為兩個類群，其中油松人工林和紅松人工林土壤真菌群落功能為一類，楊樹人工林土壤真菌功能類群為一類(圖8)。

圖 7 不同人工林相對豐度為前50的土壤真菌屬熱圖Fig. 7 The heatmap diagram of fungal genera with relative abundance of the top 50 in different plantation forest soils

為研究土壤真菌群落功能與土壤環境因子間的相關性，采用CCA分析對土壤環境因子和真菌群落功能類的關系進行限制性排序分析，如圖9所示，土壤pH (r=0.76)、可溶性有機碳(r=0.61)、C/N(r=-0.83)和速效磷(r=-0.75)與CCA1軸的相關性較大，第一軸的解釋量為53.0%。土壤速效磷(r=-0.54)與第二軸的相關性較大，解釋量為36.5%。由此可見，土壤pH、可溶性有機碳、C/N和速效磷為土壤真菌群落功能的主要影響因子。

4 討論

4.1 土壤環境因子對不同人工林的響應

不同人工防護林會顯著改變土壤化學特性。與樟子松和油松人工林相比，楊樹人工林土壤pH值最高(表1)。Yoshimura等人[29]研究發現，松樹林土壤pH值均較橡樹和樺樹林土壤低，這主要是由于針葉林凋落物含有較高的酸性物質[30]。不同森林類型土壤C/N差異顯著[31]，本研究發現人工林土壤C/N依次為油松＞樟子松＞楊樹，與以往的研究結果類似[29]。凋落物是人工林生態系統養分歸還的重要組成部分，在很大程度上影響著土壤有機質的形成[32]，與針葉樹樟子松和油松相比，楊樹能更好地提高土壤可溶性有機碳和速效磷的含量，這可能是由于不同樹種向土壤輸入的凋落物的質量和數量不同所致[33]，在相同生境中，闊葉樹種枯落物分解速率大于針葉樹種[34]，與楊樹相比，樟子松和油松凋落物分解慢，養分釋放需要時間較長，歸還量較少，從而造成針葉人工林土壤中的速效養分的含量較低。由此可見，在同一氣候條件下，人工林樹種對土壤特性存在顯著影響，尤其是在闊葉林和針葉林之間。

圖 8 不同人工林土壤真菌群落功能熱圖Fig. 8 The heatmap of the fungal community functions in different plantation forest soils.

圖 9 不同人工林土壤真菌群落功能與土壤化學特性間的CCA分析Fig. 9 CCA analysis of the soil fungal functions with soil chemical characteristics in different plantation forest

4.2 土壤真菌群落結構對不同人工林的響應

本研究發現，不同人工林土壤真菌在門、綱和屬的組成上具有一定的相似性，但是，不同人工林土壤真菌在門、綱和屬的相對豐度上存在一定差異。眾所周知，土壤微生物所利用的碳源主要來自于植物凋落物及根系分泌物，凋落物的豐富程度和品質高低直接決定微生物的數量及群落結構[35]，由于不同的植被類型具有不同的凋落物殘體和根系分泌物，所以使不同人工林土壤微生物的群落多樣性和結構存在差異[36-38]。本研究發現，在付家林場3種人工林土壤中，子囊菌門真菌為優勢菌門，擔子菌門次之，研究結果與湖南杉木人工林[39]、老撾熱帶草地[40]、關帝山森林土壤[41]、以及寧南山區人工林草[42]土壤中優勢真菌門類群相一致。Curlevski等人[43]的研究也表明，澳大利亞亞熱帶森林土壤中的子囊菌門真菌群落多于擔子菌門。然而，有研究發現中國亞熱帶森林土壤的真菌群落主要以擔子菌門為主[44]。擔子菌和子囊菌均喜歡通氣好的土壤條件[45]，它們屬于陸生菌物，是土壤有機質的主要分解者[46]。在森林土壤中，多數子囊菌為腐生菌，能夠分解角質素和木質素等許多較難降解的有機物質，在養分循環中扮演著重要作用[47]，它們通常在偏酸性土壤中大量存在。本研究發現，在pH值最低的油松人工林土壤中，子囊菌門相對豐度最高。Heatmap和NMDS分析結果表明，不同人工林土壤真菌群落存在明顯差異，尤其針葉林與闊葉林之間的差異更大。本研究結果與He等人的研究結果相類似[48]，均表明人工林樹種不同，其土壤真菌群落組成也不同[49]。

4.3 土壤真菌群多樣性與不同土壤環境因子間的相關性

土壤真菌多樣性是土壤質量變化的敏感指標，能夠反映真菌群落總體的動態變化[50]。本研究結果表明，不同人工林土壤真菌多樣性具有顯著差異，Myers等人[51]也得到相似的結果。其中，楊樹人工林土壤真菌的Simpson指數、Shannon指數、Chao1指數和ACE指數均高于樟子松和油松人工林，表明楊樹人工林土壤具有較高的真菌多樣性和均勻性，這主要是由于樟子松和油松均屬針葉林，針葉林枯枝落葉在分解過程中產生酸性物質[52]，使土壤酸性增強，且針葉樹凋落物分解慢，養分歸還少[53]，微生物活性和多樣性受到限制。可見，植被類型不僅影響土壤養分特征，也顯著影響土壤微生物群落多樣性[54]。除此之外，森林生態系統中土壤真菌多樣性還受多種土壤環境因子的影響[55]，其中，土壤酸堿度也是影響土壤微生物群落結構的重要環境因子[56]，土壤中碳、氮、磷等元素的含量也影響并制約著土壤中各類微生物群落的活性[57]，多樣性及其組成[58-59]。本研究結果表明，土壤pH值與真菌ACE指數和Chao1指數呈極顯著正相關，與關帝山森林土壤真菌群落結構的研究結果相一致[40]。真菌群落對土壤pH適應范圍較寬，pH在5～9之間的土壤均不會抑制真菌的生長[60]。本研究結果表明土壤的DOC、AP和C/N也對真菌的多樣性和真菌群落功能具有顯著影響，可能是由于不同植物物種會通過改變土壤結構和營養狀況從而間接地改變真菌的生存環境，影響土壤真菌群落多樣性以及功能特征[61]。

5 結論

楊樹、樟子松和油松為遼西北風沙地區發揮生態效應的主要造林樹種。本研究采用高通量測序與FUNGuild綜合分析的方法，對遼西風沙區3種不同造林樹種的土壤真菌群落多樣性、真菌群落結構及其功能進行了研究，結果表明：（1）楊樹人工林能顯著增加土壤pH值、土壤可溶性有機碳和速效磷的含量，降低土壤的C/N；（2）楊樹人工林能夠提高土壤微生物的多樣性，且土壤pH、可溶性有機碳、速效磷和C/N是影響該區真菌多樣性和真菌群落功能的主要因素；（3）3種人工林樣地中共有5個真菌門和13個優勢真菌屬，其中，相對豐度最大的為子囊菌門和擔子菌門；（4）Heatmap和NMDS分析結果表明不同人工林土壤真菌群落結構和功能具有一定差異，且在闊葉林和針葉林之間差異較大。試驗結果為遼西北風沙地區不同針闊樹種造林土壤養分及土壤微生物的研究等提供數據支持，也為該地區土壤改善、生態環境治理和樹種選擇提供科學依據。