雙條杉天牛不同蟲期體壁碳氫化合物變化規律分析

張時雨，張蘇芳，劉 福，馬深成，賈春燕，申衛星，張 真，孔祥波＊

(1. 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所，國家林業和草原局森林保護學重點實驗室，北京 100091；2. 山東省泰安市泰山風景名勝區管理委員會，山東 泰安 271000)

雙條杉天牛（Semanotus bifasciatus Motschulsky）是東亞特有的鞘翅目害蟲，廣泛分布于中國東北、華北、西北和華東等地區以及朝鮮、韓國和日本等國家。主要危害側柏（Platycladus orientalis （L.)Franco）、檜柏（Sabina chinensis (L.) Ant. ）和羅漢 松 （ Podocarpus macrophyllus （ Thunb.） D.Don）等樹種，尤其對我國北方地區的側柏林構成重大威脅[1]。雙條杉天牛成蟲傾向于在衰弱樹或新伐倒木樹皮翹裂縫深處產卵，幼蟲可在韌皮部和木質部蛀成不規則坑道，切斷和破壞寄主的輸導組織，影響養分的運輸最終導致寄主死亡[2]。由于幼蟲在樹皮下隱蔽危害，化學藥劑防控困難，目前主要的防治手段是餌木誘殺，雖有效果但耗時耗力、不可持續。

昆蟲表皮碳氫化合物是昆蟲表皮蠟質層中的主要成分，大多為碳數在20～50、直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴類化合物[3]。表皮碳氫化合物在昆蟲生存中扮演著重要的角色，能夠起到防止水分散失，避免機械擦傷，隔離微生物和化學物質的屏障作用[4-5]，同時也能作為昆蟲化學分類特征[6-7]。此外，其也能介導物種和性別識別，是雌雄交配信號傳遞的基礎[8-10]，在昆蟲生殖行為中扮演重要的角色。昆蟲體壁碳氫化合物的組成受到多種因素的影響，包括性別、齡期、性成熟度以及社會性昆蟲的多態性[11]。Sano等[12]發現鋪道蟻（Tetramorium caespitum L.）體壁碳氫化合物中C15～C31之間的單甲基支鏈烷烴含量為45%～56%、正烷烴含量為16%～40%、烷烯烴含量為10%～20%，相對豐度具有特異性的甲基支鏈烷烴和烷烯烴在識別同種種群和防止非同巢穴蟻群侵入方面具有信號識別作用。Balbuena等[13]發現無刺蜂（Tetragonisca angustula Latreille）負責守衛的工蜂體壁碳氫化合物中的甲基支鏈烷烴的相對豐度比巢內工蜂及負責覓食的工蜂高很多，行為試驗說明體壁碳氫化合物在種姓識別方面具有重要作用。我們在室內進行雙條杉天牛交配行為試驗，發現只有在雄蟲觸角接觸到雌蟲鞘翅體壁后，才能立即發生交尾行為，這說明體壁碳氫化合物可作為接觸性識別信息素在雌雄成蟲交配過程中發揮重要作用。本研究對雙條杉天牛老熟幼蟲、剛羽化的成蟲和揚飛期成蟲體壁碳氫化合物進行分析，探討體壁碳氫化合物成分在不同性成熟度的蟲期中的變化規律，為進一步研究其在生殖行為中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 雙條杉天牛的采集

2017年3月上旬在山東省泰安市泰山靈巖寺林區（36°21′46.95″N，116°58′32.29″E）側柏餌木堆中采集雙條杉天牛成蟲，此時達到性成熟的成蟲被餌木誘集并交配繁殖。雌蟲和雄蟲分別單獨裝入4 mL離心管中，帶回實驗室進行體壁碳氫化合物提取。同時將雙條杉天牛已經在其中產卵的餌木截成50 cm左右的木段運回實驗室，置于養蟲籠內于10月中旬劈開餌木收集老熟幼蟲，12月上旬劈開餌木收集羽化不久的成蟲進行體壁碳氫化合物的提取。

1.2 化學試劑

十一甲基二十五烷烴（11Me-C25，CAS：5689-71-1）、十一甲基二十六烷烴（11Me-C26，CAS：68547-06-8）和十一甲基二十七烷烴（11Me-C27，CAS：15689-68-6）（純度≥ 98%）標準品均購自Chemtech MD 公司（8035 Paphos，Cyprus）。C8～C40混合碳標及單一碳標C22和C29（純度≥99%）均購自美國AccuStandard公司（New Haven，Connecticut，USA）。

1.3 表皮碳氫化合物的提取

1.3.1 固相微萃取法（SPME） 使用Supelco70-μm Carbowax/divinylbenzene（CAR/DVB）纖維頭（573360U，Yellow-Green，Supelco Inc.，Bellefonte，PA）提取3月份林間揚飛期采集的雌成蟲（n=5）、雄成蟲（n=5），餌木木質部剛羽化的雌成蟲（n=4）、雄成蟲（n=4頭）及餌木木質部中的老熟幼蟲（n=4）體壁碳氫化合物成分。用鑷子夾住試蟲，用纖維頭單向輕緩地摩擦試蟲鞘翅表面30次，每兩次摩擦之間均旋轉纖維頭。取樣結束后立即將纖維頭進GC-MS進行體壁碳氫化合物成分分析。

1.3.2 溶劑浸提法 使用移液槍取1 mL分析純正己烷淋洗雙條杉天牛揚飛期雌成蟲（n=5）和雄成蟲（n=5）及木質部中剛羽化的雌成蟲（n=6）和雄成蟲（n=5）體壁，每頭成蟲淋洗6次（共計6 mL淋洗液），提取成蟲體壁碳氫化合物。用4 mL色譜純正己烷浸泡雙條杉天牛幼蟲（n=8）3 min，提取幼蟲體壁碳氫化合物成分。成蟲體壁淋洗液及幼蟲浸提液在微弱的氮氣流下濃縮至2 mL，放入-20℃冰箱中保存以備GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析

固相微萃取法和溶劑提取法提取的樣品以及標準品均在Finnigan Trace DSQ氣相色譜-質譜聯用儀上分析。氣相色譜分析條件：進樣口和傳輸線溫度均為220 ℃，氦氣為載氣（流速1.0 mL·min-1），HP-5MS 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm i.d. × 0.25 μm膜厚，J&W Scientific，Folsom，CA，USA）。色譜升溫程序：60 ℃保持1 min，10 ℃·min-1升溫至300 ℃，保持10 min。質譜分析條件為：在燈絲電流70 eV的電子轟擊源（EI）模式下，離子源溫度為220℃。全掃描質量范圍是41～560 amu，以獲取總離子流色譜圖（TIC）進行定性定量分析。固相微萃取CAR/DVB纖維頭插入進樣口，在無分流模式下熱解析1 min，然后開始運行色譜程序。

體壁碳氫化合物的定性鑒定是通過與標準品比較色譜保留時間、特征碎片離子及豐度比以及使用Kováts保留指數和NIST11譜庫進行輔助鑒定。體壁碳氫化合物各色譜峰定量方法是與加入的已知含量的C22峰面積進行比較，確定各成分的絕對含量。

1.5 統計分析

C8～C40混合碳標進行GC-MS分析，記錄各烷烴的保留時間，根據下面公式對分析樣品的Kováts保留指數值進行計算[14]。

“N”和“n”表示分析樣品色譜峰前后正烷烴色譜峰具有的碳原子數量，“tR（N）”和“tR（n）”表示分析樣品前后正烷烴標準品色譜峰的保留時間，“tR（unknown）”表示待鑒定樣品色譜峰保留時間。

SPME分析獲得的百分含量數據經過arcsin√p轉化后進行單因素方差分析（ANOVA），采用LSD法對處理間平均數進行差異顯著性檢驗（α=0.05和α=0.01，SPSS Statistics17.0）。絕對含量數據進行非參數檢驗（Nonparametric tests），對同一成分在不同蟲期含量數據采用Kruskal-Walls檢驗分析，組間差異顯著的成分再進一步進行兩兩比較（α=0.05 和 α=0.01，SPSS Statistics17.0）。

2 結果與分析

2.1 SPME提取的雙條杉天牛3個蟲期體壁碳氫化合物分析

固相微萃取法提取雙條杉天牛3個蟲期體壁碳氫化合物分析結果表明，體壁碳氫化合物成分主要由正烷烴、烷烯烴和甲基支鏈烷烴構成（圖1，表1）。幼蟲體壁碳氫化合物中n-C27、n-C25和角鯊烯（squalene）含量較高，三者占總碳氫化合物含量的61.75%；其次為3Me-C25和n-C29，含量占25.90%。在個別幼蟲體壁碳氫化合物中檢測出n-C15和n-C16成分，在全部幼蟲體壁中未檢測出11Me-C25、11Me-C26、11Me-C27和 3Me-C27成分。剛羽化的成蟲體壁碳氫化合物中n-C25和n-C27含量較高，未檢測到3Me-C27、n-C31和角鯊烯成分，雄成蟲比雌成蟲多n-C15、n-C16和n-C19，其他成分雌雄一致且3Me-C25、11Me-C27和n-C28在雌雄體壁碳氫化合物中差異顯著。揚飛期雌雄成蟲體壁碳氫化合物成分一致，n-C25含量最高，其次是 n-C26和 3Me-C25。另外，11Me-C25、3Me-C25、11Me-C26、11,15diMe-C27和n-C285種成分在雌雄成蟲體壁中的相對百分含量差異顯著。27

圖 1 固相微萃取提取雙條杉天牛老熟幼蟲體壁碳氫化合物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the cuticular hydrocarbonssampled by SPME from mature larvae of Semanotus bifasciatus

碳氫化合物成分n-C23、n-C24和3Me-C27僅在揚飛期雌雄成蟲體壁中檢測到，且在雌雄兩性成蟲中相對含量差異不顯著。n-C25在3個蟲期體壁中相對百分含量均最高，相互間差異不顯著。n-C26在揚飛期雌雄成蟲體壁中的含量極顯著高于幼蟲和剛羽化的雌雄兩性成蟲（F=33.77，P=0.001）。n-C在3個蟲期體壁碳氫化合物中相對百分含量呈下降趨勢，且揚飛期雌雄成蟲相對百分含量極顯著低于幼蟲和剛羽化的雌雄成蟲（F=9.66，P=0.001）。n-C28在3個蟲期中相對百分含量均較低，剛羽化的雌成蟲體壁中的含量顯著高于其他蟲期（F=12.78，P=0.02）。n-C29在幼蟲體壁中的含量極顯著高于剛羽化的雌雄成蟲體壁中的含量（F=42.49，P=0.01），但是在揚飛期雌雄成蟲中未檢測到該成分。n-C31僅在幼蟲體壁碳氫化合物中檢測到。

表 1 雙條杉天牛不同蟲期固相微萃取法提取的體壁碳氫化合物的GC-MS分析結果Table 1 Cuticular hydrocarbons analyzed by SPME-GC-MS from different developmental stages of Semanotus bifasciatus

體壁碳氫化合物中11Me-C25的含量隨蟲體的發育呈現增長，在揚飛期雌雄兩性中占比極顯著高于剛羽化的雌雄兩性（F=57.32，P=0.001），且在揚飛期雄性成蟲體壁中的占比極顯著高于雌性（F=12.86，P=0.016）。11Me-C26在揚飛期雄成蟲體壁碳氫化合物中的占比高達11.95%，而在其他蟲期中該成分的占比僅在1.5%～3.0%之間，極顯著高于其他蟲期體壁碳氫化合物中的占比（F=56.65，P=0.001）。11Me-C27在揚飛期雌雄兩性成蟲及剛羽化的雌蟲體壁碳氫化合物中所占比例相近且差異不顯著，但是顯著高于剛羽化的雄成蟲（F=6.69，P=0.009）。3Me-C25在雌成蟲體壁碳氫化合物中占比顯著高于雄成蟲（F=5.90，P=0.045）。3Me-C27在揚飛期雌雄兩性成蟲體壁碳氫化合物中占比差異不顯著。11,15diMe-C27在幼蟲與揚飛期雄成蟲之間占比差異不顯著（P＞0.05），在剛羽化的雌雄成蟲及揚飛期的雌成蟲之間差異也不顯著。該成分在揚飛期雌雄成蟲體壁碳氫化合物相對含量間差異顯著（F=12.78，P=0.023）。

2.2 溶劑浸提法提取的3個蟲期體壁碳氫化合物分析

幼蟲體壁碳氫化合物中n-C31（1.44 ng）是成蟲所不具有的，這與SPME分析結果一致；但是沒有檢測到角鯊烯，這與SPME分析結果相反。在幼蟲體壁碳氫化合物中未檢測到C15～C24的正烷烴及11Me-C26、11Me-C27和3Me-C27的甲基支鏈烷烴。剛羽化的雌雄成蟲體壁碳氫化合物成分基本一致，且雌雄間含量差異不顯著；n-C15和n-C16僅在剛羽化的雄成蟲體壁中存在，而n-C18在剛羽化的雌雄成蟲體壁中均檢測到。在揚飛期性成熟的雌雄成蟲體壁碳氫化合物成分一致，但是11Me-C26（χ2=4.50，P=0.034）、11Me-C27（χ2=6.00，P=0.034）、11,15diMe-C27（χ2=5.06，P=0.023）和3Me-C27（χ2=4.50，P=0.034）在雌性成蟲體壁中的含量均顯著高于雄性成蟲體壁中的含量；n-C23、11Me-C26和3Me-C27在幼蟲和剛羽化的雌雄成蟲體壁中未檢測到，在揚飛期雌雄成蟲體壁碳氫化合物中含量介于2～13 ng之間。其他成分含量雌雄個體間雖然沒有統計差異（例如，3Me-C25，χ2=3.76，P=0.053），但是雌性個體體壁碳氫化合物含量均高于雄性個體（n-C23和n-C24除外）（表2）。

表 2 雙條杉天牛不同蟲期溶劑浸提法提取的體壁碳氫化合物GC-MS分析結果Table 2 Cuticular hydrocarbons analyzed by hexane extract-GC-MS from different developmental stages of Semanotus bifasciatus

n-C24在雌雄成蟲間差異不顯著（χ2=6.60，P=0.086），但是剛羽化的雌雄成蟲體壁中的含量均低于揚飛期雌雄成蟲體壁中的含量。n-C25在幼蟲體壁中含量顯著低于剛羽化的雌蟲（χ2=8.817，P=0.003）、揚飛期雌蟲（χ2=6.00，P=0.014）和揚飛期雄蟲（χ2=4.50，P=0.034）體壁中的含量；相反n-C27在幼蟲體壁中含量顯著高于剛羽化的雌蟲（χ2=9.60，P=0.002）、雄蟲（χ2=7.39，P=0.007）；以及揚飛期的雌蟲（χ2=8.595，P=0.003）和雄蟲（χ2=6.00，P=0.014）體壁中的含量。n-C26在幼蟲和剛羽化的雌雄成蟲體壁中含量差異不顯著，均在2～3 ng之間，而在揚飛期雌雄兩性成蟲體壁中該成分的含量顯著增高（χ2=6.00，P=0.014），達到30～60 ng。n-C28在3個蟲期的體壁碳氫化合物中均被檢測到，含量在1.5～6.5 ng之間，且各蟲期間差異不顯著。n-C29在揚飛期成蟲體壁中未被發現，在幼蟲體壁中的含量顯著高于剛羽化的雌雄兩性成蟲（χ2=2.40，P=0.012）。

11Me-C25在揚飛期雌雄兩性成蟲體壁碳氫化合物中的含量顯著高于剛羽化的雌雄成蟲及幼蟲。3Me-C25在3個蟲期體壁碳氫化合物中含量差異顯著（幼蟲期：剛羽化成蟲期，χ2=9.60，P=0.002；剛羽化成蟲：揚飛期成蟲，χ2=7.50，P=0.006），且含量隨著天牛的發育明顯增多，由幼蟲期的5.79 ng增長到揚飛期雌性成蟲中的67.27 ng。11Me-C27在揚飛期雌性成蟲體壁中的含量顯著高于剛羽化的雌雄兩性成蟲和揚飛期雄性成蟲體壁中的含量（χ2=6.00，P=0.014），且隨著雌雄成蟲的發育呈現增長趨勢。11,15diMe-C27在幼蟲、未成熟兩性成蟲和成熟雄性體壁中的含量差異不顯著，但在揚飛期雌性成蟲體壁中的含量顯著增高（χ2=7.53，P=0.006）。3Me-C27在揚飛期雌成蟲體壁中的含量顯著高于雄成蟲體壁中的含量（χ2=4.50，P=0.034）。

3 討論

昆蟲體壁碳氫化合物既具有保護昆蟲的物理功能，又具有種內化學信息交流和種間物種識別等生物學功能，其種類組成及含量可隨著發育階段的變化而變化。例如，點蜂緣蝽（Riptortus pedestris Fabricius）不同發育階段體壁碳氫化合物主要成分由27%～63%的正烷烴構成，其次是單甲基支鏈烷烴和二甲基支鏈烷烴。若蟲期主要碳氫化合物成分是n-C29；剛羽化的成蟲主要成分是n-C27，也含有很多甲基支鏈烷烴；成蟲期主要成分是n-C31、n-C27、13,17diMe-C33和 15,19diMe-C33[15]。天牛科昆蟲雌雄生殖交流的化學信號多為體壁碳氫化合物中的甲基支鏈烷烴或者烯烴以及少數正烷烴。例如，厚墊黃帶蜂天牛（Megacyllene caryae Gahan）的接觸性信息素成分是Z9-C29[16]，而南美硬木鋸天牛（Mallodon dasystomus Say）的接觸性信息素成分是2Me-C26和2Me-C28[17]，這2種天牛雌雄體壁碳氫化合物成分及含量均有很大差異。作為介導雌雄識別的化學信號通常是由多種碳氫化合物組成，有的起主導作用，有的起增效作用。例如，黑腹尼虎天牛（Neoclytus acuminatus acuminatus Fabricius）雌成蟲具有6種甲基支鏈的烷烴是雄成蟲所不具有的，其中7Me-C27、7Me-C25和9Me-C27占其體壁碳氫化合物總量的40%左右，7Me-C27單獨使用就能激起雄成蟲的交尾行為，而與7Me-C25和9Me-C27共同使用具有與雌成蟲相同的生物活性[18]。

本研究明確了雙條杉天牛老熟幼蟲、剛羽化的成蟲及揚飛期成蟲3個發育階段蟲體體壁碳氫化合物的組成及變化規律。不同蟲期雙條杉天牛體壁碳氫化合物成分主要包括C15～C31之間的正烷烴、5種單甲基支鏈烷烴和1種二甲基支鏈烷烴。揚飛期成蟲雌雄體壁成分沒有質的差異，但是4種甲基支鏈烷烴在雌蟲體壁中含量顯著高于雄蟲。剛羽化的雌雄成蟲體壁碳氫化合物成分沒有質和量的差異。n-C23、n-C24、n-C25、11Me-C25、3Me-C25、n-C26、11Me-C26和3Me-C27在雙條杉天牛體壁中的含量隨著蟲齡的增加而顯著增高，而n-C15、n-C16、n-C29和n-C31正烷烴含量減少直至消失，體壁碳氫化合物種類及含量隨著發育時間的變化而變化可能與不同蟲態代謝差異有關[19]，同時這幾種物質的變化也可能與雙條杉天牛發育成熟后物種信息識別和種群繁衍等生物功能相關。雙條杉天牛幼蟲和揚飛期成蟲體壁碳氫化合物比較分析發現，幼蟲體壁碳氫化合物中不含有11Me-C26、11Me-C27和3Me-C27；幼蟲不具有交配行為，這3種成分的缺失可能意味著其在成蟲生殖行為中扮演著重要的生物學功能。11Me-C26、11Me-C27和3Me-C27這3種成分的絕對含量在揚飛期雌雄兩性成蟲中差異顯著，可能暗示著雄成蟲是根據這3種成分量的差異來鑒別異性從而順利完成交配行為。另外，11Me-C25、3Me-C25和11,15diMe-C27在雌雄兩性成蟲體壁碳氫化合物中的占比差異顯著，也不排除其參與雌雄兩性配偶識別。一種或多種組分在一定比例下可能作為雙條杉天牛的接觸性識別信息素或增效劑介導性識別，在將來的研究中需要對雙條杉天牛的接觸性信息素的存在與否進行驗證，并對接觸性信息素的具體比例開展進一步研究。

昆蟲體壁碳氫化合物既可以作為種間物種鑒別的重要特征，又可以探討不同地理種群之間的差異，甚至在親代養育中也發揮重要作用。隨著昆蟲發育階段的不同，體壁碳氫化合物處在動態變化的過程中。部分成分隨著蟲體發育含量顯著上升，但是占比不變或者下降，部分成分在同時期雌雄兩性間含量和占比差異顯著；特別是幼蟲和成蟲相比體壁碳氫化合物成分及含量存在很大差異。成蟲期體壁碳氫化合物穩定，作為種類鑒別特征更具有代表性，而幼蟲期體壁碳氫化合物不適合作為種類鑒定的特有特征。在物種鑒別方面，盡管黑山大小蠹（Dendroctonus ponderosae Hopkings）和光背大小蠹（D. jeffreyi Hopkins）體壁碳氫化合物基本一致，但是3,7-二甲基烷烴能夠很好的區分這兩個近緣種。瘤額大小蠹（D. frontalis Zim.），其特征體壁碳氫化合物是3,X-二甲基二十九烷烴，而西松大小蠹（D. brevicomis LeConte）的特征體壁碳氫化合物是C31～C35的正烷烴。寄主和地理差異沒有從本質上改變瘤額大小蠹體壁碳氫化合物的差異，且雌雄蟲體壁碳氫化合物也沒有質和量的差異[6]。臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus Shiraki）4個地理種群工蟻和兵蟻體壁碳氫化合物沒有質的差異，但是工蟻7種碳氫化合物含量差異、兵蟻3種碳氫化合物含量差異能夠區分不同地理種群，而種群內部不同個體間這幾種成分含量差異很小[20]。雙條杉天牛體壁碳氫化合物是否存在不同地理種群間的差異，以及與其他天牛種類之間特征體壁碳氫化合物的異同，我們將在今后的工作中開展進一步研究。

4 結論

本研究通過氣相色譜-質譜聯用儀對3個蟲期的雙條杉天牛體壁碳氫化合物進行分析，發現不同蟲期的雙條杉天牛的體壁碳氫化合物存在顯著差異。幼蟲體壁碳氫化合物主要以C15～C31正烷烴為主，甲基支鏈烷烴種類和含量較少。隨著蟲齡的增長和成蟲羽化后時間的推移，體壁碳氫化合物中甲基支鏈烷烴的含量顯著增加，而正烷烴在體壁碳氫化合物中的占比呈下降趨勢。這對雙條杉天牛種間、種內化學信號識別機制研究奠定基礎。