馥郁滇丁香LgFKF1基因的克隆及節律表達分析

萬友名，馬 宏，劉雄芳，張 序，安 靜，劉秀賢，李正紅

(中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224)

植物可通過感知光周期的晝夜變化和季節日照時間的長短，來調節啟動開花的時間[1-2]，這是內部節律基因與外部環境信號參與時間調控機制相互作用的結果[3]。FKF1是在研究晚花突變體時發現的藍光特異性光受體基因[4-5]，它受晝夜節律鐘和光信號調控，位于開花促進基因CO、FT的上游[3]。在藍光介導下，FKF1能與GI蛋白發生互作形成FKF1-GI復合體，該復合體能通過泛素化途徑的26S蛋白酶復合體降解CO的抑制因子CDF1，進而正向調節CO的轉錄水平[4,6-7]；另外，FKF1還能與開花促進基因CO直接互作并穩定CO的表達[8-9]。因此，在光周期途徑中，FKF1在應答光信號、節律信號以及調控下游開花促進基因CO上起著重要的作用。目前，有關FKF1基因的研究主要集中在1年生草本植物中，而在多年生木本植物中的研究相對較少。在擬南芥（Arabidopsis thalia-na （Linn.) Heynh.）[5,7]、大豆（Glycine max (Linn.)Merr.）[10]中，fkf1突變體會延遲開花，而過量表達則引起提前開花。在水稻（Oryza sativa Linn.）中，FKF1的調控功能仍不清楚，它不受光周期影響就能促進開花，可能是一種自主的成花啟動因子，也可能是通過其特異的功能來調控水稻特異基因Ehd2、Ghd7、Ehd1的表達[11]。因此，FKF1基因在不同光周期類型的植物中存在功能差異。

馥郁滇丁香（Luculia gratissima (Wall.) Sweet）屬于典型的短日照多年生木本植物[12]，是一種具有較高觀賞價值的木本花卉，既可盆栽又可園林配置[13]。本課題組在前期的轉錄組測序中鑒定出馥郁滇丁香FKF1的同源基因，并發現其相對于非誘導光周期，在誘導光周期下呈顯著下調表達，這與報道的草本植物的光周期成花表達模式相反。本研究根據轉錄組的信息，利用RACE技術克隆獲得LgFKF1基因的cDNA全長序列，并對其進行生物信息學分析；同時，利用qRT-PCR對LgFKF1在特異組織中的節律表達進行分析，旨在為進一步研究FKF1的生物學功能提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料準備

以馥郁滇丁香品種‘香妃’扦插苗為試材。于2016年12月15日扦插，當生根的幼苗新長出2～3個莖節時，去除所有植株的頂端分生組織，并移入非誘導光周期（22：00～2：00暗中斷補光，光照強度為 1.8～2.3 μmol·m-2·s-1）的溫室中培養；同時，在自然環境中放置部分植株設為對照。當對照植株出現花芽分化后，開始進行誘導光周期（光照/黑暗為10 h/14 h）處理。

1.2 材料處理

1.2.1 基因克隆 根據前期的轉錄組測序結果為依據，選取誘導光周期處理7、10、13、19 d 4個時間點取樣。每個時間點隨機選10株單株，每個單株取主枝上的1個芽，共10個芽，采集的樣品液氮速凍后-80℃保存。等量混合4個時間點的樣品進行cDNA全長序列克隆。

1.2.2 光周期表達分析 參照萬友名等[12]的方法，將非誘導光周期中培養的植株移入誘導光周期中進行誘導處理。自處理開始，每隔3～5 d隨機選取10株植株，每株采集健壯主枝上的頂芽1個，共10個芽混合為1個樣，重復3次。與此同時，每次都采用相同的方法在非誘導光周期中采集樣品設為對照。每次在上午9：00—11：30采樣。采樣自誘導光周期處理開始至花蕾現蕾。所有樣品采集后液氮速凍并保存在-80℃冰箱中用于qRT-PCR分析。然后，根據萬友名等[12]的形態學觀察結果，選取誘導光周期處理7 d（未分化期）、10 d（總苞原基分化期）、13 d（花序原基分化期）、19 d（小花原基分化期）4個時間點的樣品及其對照樣品進行qRT-PCR分析，共24個樣。

1.2.3 特異組織表達分析 于‘香妃’的盛花期，選取一天24 h，從早8：00開始，每隔3 h從種植條件一致的同一批試驗材料中分別采集根（T1）、莖（T2）、葉（T3）、營養芽（T4）、著色期花蕾（T5）、露白期花蕾（T6）及開放的花朵（T7）1次，每次每個組織取300～500 mg，重復3次。所有樣品采集后立即液氮速凍并保存于-80℃冰箱中用于qRT-PCR分析。

1.3 RNA的提取及反轉錄

樣品經液氮研磨后，按照生工生物工程（上海）公司提供的柱式植物總RNA抽提純化試劑盒（SKB8661）說明書操作提取總RNA。利用第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）(Thermo ScientificTMEP0733)按說明書操作將提取的RNA反轉錄成cDNA。

1.4 基因克隆

以轉錄組測序結果為基礎，經信息分析獲得與FKF1功能相似的 Unigene片段，并命名為LgFKF1。采用 Primer premier 5.0軟件設計引物（表1）。然后，以合成的cDNA為模板，利用LA Taq(TaKaRa DRR02AG)進行PCR擴增，具體方法按照說明書操作。PCR反應條件為：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 60 s，33個循環，72℃ 修復延伸 7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。采用柱式DNA膠回收試劑盒（生工B518131）回收目的條帶。回收的目的片段連接pGM-T載體后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37℃過夜培養，篩選陽性克隆送至生工生物工程（上海）公司測序。

1.5 生物信息學分析

克隆拼接獲得的序列經NCBI的ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析翻譯成氨基酸序列，然后，通過BLAST（http://b-last.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行蛋白序列的同源性比對，同時，選取部分相似度高的同源蛋白序列利用DNAMAN5.1軟件進行同源性比對；利用ProtParam（http://www.expasy.org/tools/protp-aram.html）在線工具軟件預測分析蛋白的理化性；利用ProtScale（https://web.expas-y.org/cgi-bin/pro-tscale/protscale.pl）進行親/疏水性預測分析；利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白的信號肽；利用PROTTER（http://wlab.ethz.ch/protter/start/）建立蛋白跨膜結構模型；利用SOPMA（ https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線軟件分析蛋白的二級結構組成；利用 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）同源建模方法得到蛋白的三維預測模型；利用ProtComp9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&grou-p=programs&subgroup=proloc)進行亞細胞定位預測；利用MEGA 5.0軟件構建蛋白系統進化樹。

表 1 LgFKF1克隆及qRT-PCR的引物Table 1 Primers for LgFKF1 cloning and qRT-PCR

1.6 基因qRT-PCR分析

總RNA的提取及cDNA反轉錄同上，引物詳見表1。以cDNA為模板，LgACT為內參基因，在LightCycler480 II上按照羅氏公司的SG Fast qPCR Master Mix（2×）(B639271)說明書進行qRTPCR反應。反應體系為：SybrGreen qPCR Master Mix（2×）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，ddH20 7.2 μL，cDNA 模板 2 μL，總體系共20.0 μL。反應條件為：95℃預變性90 s，95℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環。所有樣品反應設3次技術重復。

利用2-ΔΔCT法計算基因的表達量。采用Excel2010和SPSS16.0進行數據整理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 基因克隆

將轉錄組獲得的LgFKF1核心序列與克隆的5xRACE序列、3xRACE序列（圖1）比對拼接后，獲得LgFKF1的cDNA全長序列。利用DNAMAN5.1軟件對序列分析表明：該序列片段大小為2 271 bp，A、C、G、T堿基含量分別為26.9%、18.5%、26.1%、28.5%。經NCBI的ORF Finder軟件分析，LgFKF1基因開放閱讀框為1 917 bp，編碼一個638個氨基酸的蛋白質（圖2A）。將翻譯成氨基酸的序列用BLASTp比對表明：該序列與扁果樹（Kaliphora madagascariensis AML77708.1）、軟枝黃蟬（Allamanda cathartica AML77851.1）、納塔爾倒吊筆（Wrightia natalensis AML76886.1）、馬利筋（Asclepias curassavica AML76817.1）的 FKF1一致性較高，達92.59%（圖2B）。

圖 1 馥郁滇丁香LgFKF1基因的PCR擴增Fig. 1 PCR amplification of LgFKF1 in L. gratissima

2.2 蛋白序列分析

在線工具ProtParam蛋白理化性分析表明：蛋白質分子式為C3101H4889N881O942S28，相對分子量為70.483 kD，等電點（pI）5.63，不穩定指數為49.94，推測屬于不穩定蛋白，酸性氨基酸殘基總數（Asp+Glu）為84，堿性氨基酸殘基總數（Arg+Lys）為69，平均親水系數（GRAVY）為-0.294，脂肪系數為83.97。

圖 2 核苷酸、氨基酸序列及氨基酸同源序列比對Fig. 2 Sequence of nucleotide and amino acid, and homologous alignment of amino acid sequences

LgFKF1蛋白通過軟件SOPMA分析二級結構組成表明：二級結構由45.92%的無規則卷曲結構、24.29%的α螺旋結構、23.04%的擴展長鏈和6.74%的β-轉角構成（圖3A）；軟件SWISS-MODEL蛋白的三維預測建模發現：三級結構由α螺旋、擴展長鏈和無規則卷曲構成（圖3B），與二級結構預測的結果基本一致。SignalP4.1 Server預測表明：不存在信號肽。PROTTER預測表明：無跨膜結構區（圖3C），說明該蛋白屬于非分泌蛋白，在細胞質中合成后不被轉運；軟件ProtScale預測蛋白親/疏水性結果表明：蛋白親水性氨基酸均占65%，疏水性氨基酸均占35%（圖4），由此說明，親水區域分布面積較廣，所占比例較高；疏水區域分布面積較少，所占的比例較低，因此，推測LgFKF1蛋白為親水性蛋白。在線軟件ProtComp 9.0預測亞細胞定位在細胞核中的可能性最大，為9.92。蛋白系統進化分析（圖5)表明：LgFKF1蛋白與扁果樹（Kaliphora madagascariensis AML77708.1）親緣關系最近，軟枝黃蟬（Allamanda cathartica AML77851.1）、納塔爾倒吊筆（Wrightia natalensis AML76886.1）、馬利筋（Asclepias curassavica AML76817.1）次之，與舞草（Codariocalyx motorius AML78631.1）、菜豆（Phaseolus vulgaris XP-007160435.1）最遠。

注：A：二級結構。藍色表示α螺旋，紫色表示無規則卷曲，紅色表示延伸鏈，綠色表示β-轉角；B：三級結構；C：跨膜結構模型Notes:A: Secondary structure. The blue stands for alpha helix, the purple stands for random coil, the red stands for extended strand, and the green stands for beta turn; B: Three-dimensional structure; C: Transmembrane model

圖 4 LgFKF1蛋白的親疏水性預測結果Fig. 4 Bioinformatic prediction for hydrophily/hydrophobicity of LgFKF1 protein

2.3 特異組織節律表達分析

2.3.1 不同光周期的表達分析 在短日照誘導光周期處理7 d時，LgFKF1較長日照非誘導光周期的表達量高，之后，在處理10、13、19 d的表達量均低于長日照的表達量，并且在成花形態發生明顯轉變時（即花序原基分化期，短日照處理13 d）表達量達最低（圖6）。由此說明，LgFKF1在成花轉變狀態下呈下調表達，這與轉錄組測序的結果一致。

2.3.2 特異組織表達分析 一天24 h中，LgFKF1基因在各組織中的表達分析(圖7）表明：在根中，14:00為一天中表達量最低點，之后逐漸升高，并于23:00達到最高峰，隨后又波動降低；在莖中，8:00為一天中表達量最低點，隨后逐漸升高，并于20:00達到第1個高峰后又逐漸降低直至2:00，之后又開始升高，并于5:00達到與第一個峰值相當的第2個高峰，隨后又降低進入下一輪循環；在葉中，8:00 為一天中表達最高峰，11:00為一天中表達的最低峰，之后在14:00回升后又逐漸降低直至23:00，隨后又在2:00升高達到第二個高峰后再次降低進入下一輪循環；在頂芽中，8:00為一天中表達最低點，之后逐漸升高，直至23:00達到最高峰，隨后逐漸降低進入下輪循環；在著色期和露白期花蕾中，表達規律基本一致，即11:00為一天中表達最低點，之后逐漸升高，直至23:00達到一天中最高峰后又逐漸降低進入下輪循環；在開放花朵中，14:00為表達最低點，之后逐漸升高，直至23:00后小幅度降低后又在5:00升高到一天中的最高峰，隨后降低進入下輪循環。總體看，LgFKF1一天24 h內在各組織中在20:00—5:00期間的表達量較高，而在11:00—14:00期間的表達量較低。從各組織的平均表達情況看，平均表達量由高到低的順序依次為：葉＞開放花朵＞著色期花蕾＞頂芽＞露白期花蕾＞莖＞根。

圖 5 LgFKF1蛋白的進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree of LgFKF1 protein

圖 6 LgFKF1在不同光周期下的表達Fig. 6 Expression of LgFKF1 under different photoperiods

圖 7 LgFKF1的時空表達Fig. 7 Spatio-temporal expression of LgFKF1

3 討論

本研究中，同源性比對結果顯示，LgFKF1與扁果樹、軟枝黃蟬、納塔爾倒吊筆、馬利筋的FKF1具有較高的同源性，而與研究成熟的擬南芥、水稻等草本模式植物的FKF1比對則沒有達到較高的同源性。然而，與LgFKF1同源性較高的這些物種的FKF1生物學功能研究目前未見報道。因此，推測LgFKF1由于序列結構有別于草本模式植物，其功能也可能與草本模式植物存在差異。另外，生物信息學分析表明，LgFKF1蛋白具有不含信號肽，無跨膜結構，屬于非分泌型親水蛋白，亞細胞預測定位在細胞核，符合擬南芥[14]、大豆[10]FKF1蛋白的特征，滿足FKF1基因發揮轉錄調控作用的要求。

在擬南芥中，AtFKF1在長日照下促進開花，短日照下開花表型不明顯[4-5]；而大豆GmFKF1轉基因植株在長日照下大部分稍微晚花，而過表達植株在短日照下有50%以上表現為極早花[10]。在本研究中，相對于非誘導光周期，LgFKF1在誘導光周期下除了在較短時間處理上上調表達外，隨處理時間延長均下調表達。由此暗示，馥郁滇丁香LgFKF1在成花狀態下處于下調表達，其功能可能與擬南芥、大豆的FKF1有所不同，值得進一步進行功能驗證。

不同植物的FKF1同源基因節律表達規律不盡相同。在擬南芥中，AtFKF1在長日照下表達峰值出現在早上10:00，在短日照下表達峰值出現在早上7:00[15]；大豆GmFKF1的表達在短日照下僅在早上10：00達到峰值，在長日照下僅在早上12:00達到峰值[10]；短日照洋蔥（Allium cepa）品種中，AcFKF1在長日照和短日照下的表達都出現在早上7:00—8:00[16]。研究表明，FKF1在許多組織中均有表達，而以葉片中的表達量最高[17]。本研究中，LgFKF1除葉片中在早上8:00的表達峰值出現在白晝中，其余各組織中的表達峰值均出現在夜間，并且一些組織中還出現表達雙峰值，這與報道的草本植物存在差異。由此推測，馥郁滇丁香LgFKF1基因在成花調控中可能具有特異的生物學功能。

4 結論

從馥郁滇丁香中克隆獲得了FKF1同源基因LgFKF1，該基因編碼長度為638 aa的蛋白質，具有不含信號肽、無跨膜結構、屬于非分泌型親水蛋白以及亞細胞預測定位在細胞核等特征。隨誘導光周期處理時間延長，LgFKF1相對于非誘導光周期呈下調表達；在誘導光周期下，根、芽及花蕾中出現單峰表達，而莖、葉及開放的花朵中出現雙峰表達；除早上8:00葉片中的表達峰值出現在白晝，其余各組織中的表達峰值均出現夜間；一天中，葉片中的表達量最高。本研究為LgFKF1基因生物功能的進一步研究提供參考依據。