Mn2+和Co2+脅迫對舞毒蛾幼蟲營養和抗氧化力的影響

國嘉興，曾健勇，石疆紅，石中斌，張國財，張 杰

(東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

舞毒蛾(Lymantria dispar)屬鱗翅目毒蛾科，是一種雜食性林木葉部害蟲[1]，可以取食楊樹、榆樹、松樹等500多種植物[2]，具有分布廣、危害重、幼蟲順風遷徙等特點[3]。重金屬是指錳、鈷、銅、鉛、鎳等比重大于4.5 g·cm-3的一類很難被自然降解的重金屬元素[4]。重金屬廣泛存在于自然環境中，采礦、化石燃料燃燒、工業廢棄物排放等活動可將重金屬帶入環境，形成一種具有長期性、不可逆性和隱蔽性的累積污染，對整個生態系統造成潛在的破壞[5]。重金屬離子能和生物體內蛋白質及酶等發生作用，使它們失去活性，并對生物造成很大的危害。而且通過食物鏈的傳遞作用，重金屬可以不斷在人體內富集，對人類的健康造成很大威脅[6-7]。

隨著我國經濟的高速發展，重工業對環境所造成的污染也在不斷加劇，同時重金屬污染已成為全球嚴重的生態問題[8]。在電池制造廠附近，大量的重金屬錳、鈷被排入河水以及周圍環境中對農業也造成了巨大的危害[7]。本研究采用加有Mn2+和Co2+的人工飼料飼喂舞毒蛾幼蟲，測定了舞毒蛾幼蟲營養取食指標、營養成分含量以及總抗氧化力。擬為錳和鈷污染對生物的影響研究及重金屬污染地區的舞毒蛾防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

舞毒蛾蟲卵及飼料購自中國林業科學研究院。總抗氧化力試劑盒購于南京建成生物研究所。六水氯化鈷（分析純），購自天津市巴斯夫化工有限公司；四水氯化錳（分析純），購自天津市東麗；牛血清白蛋白（生物純），購自Biotopped Science&Technology Co.Ltd；總抗氧化力試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 舞毒蛾幼蟲飼養 舞毒蛾蟲卵用10%甲醛溶液浸泡1 h消毒，流水沖洗30 min，晾干后置于(25±1)℃、光照周期16 L:8 D、相對濕度75±1%條件下孵化，用人工飼料飼養，每兩天更換飼料，清理養蟲盒[9]。

1.2.2 重金屬處理 先進行毒力測定，取濃度為0.2 、0.4、0.8 mmol·g-1Mn2+的四水氯化錳混合飼料和 0.42、0.83、1.66 mmol·g-1Co2+的氯化鈷溶液分為6組，每組10只蟲，觀察舞毒蛾4齡幼蟲的死亡率，發現0.40 mmol·g-1Mn2+的四水氯化錳混合飼料和0.83 mmol·g-1Co2+的六水氯化鈷混合飼料處理的舞毒蛾4齡幼蟲84 h時死亡率同為30%。因此取配制好的四水氯化錳溶液和六水氯化鈷溶液各40 mL煮沸，然后分別加入干飼料11 g、瓊脂0.8 g煮沸后倒入飼料盒中配制成兩種混合飼料。選取大小一致的舞毒蛾4齡幼蟲，采用兩種混合飼料分別進行飼喂處理。以蒸餾水配制飼料作為對照。觀察84 h后測定舞毒蛾幼蟲的死亡率、取食量、蟲糞量、體質量增長量，然后取存活幼蟲液氮研磨后，放置于-80℃冰箱保存。每組處理幼蟲30頭，水平重復為3次。

1.2.3 營養成分含量測定 取研磨樣品100 mg，加入 0.9%的 NaCl溶液900 μL，漩渦振蕩抽提2 min，4 ℃、2 500 r ·min-1離心 10 min，取上清液作為蛋白質、碳水化合物及海藻糖含量測定的樣品溶液[10]。蛋白質含量采用Bradford考馬斯亮藍G-250染色法進行測定[11]，碳水化合物含量測定參考J.H. Roe[12]的方法進行測定，海藻糖含量參照雷芳等蒽酮法[13]測定，脂質含量參照P. Simek等的方法[14]測定。

1.2.4 總抗氧化力測定 總抗氧化力采用南京建成生物工程研究所總抗氧化力試劑盒，按說明書進行測定計算，測定時用雙蒸水調零，波長520 nm，每個測定管設一個對照管。

1.3 數據統計分析

采用SPSS 21.0軟件和Excel軟件進行數據統計分析。數據以“平均值±標準誤”表示。采用配對樣本T檢驗分析處理組與對照組之間的差異顯著性。柱形圖繪制均采用Origin Pro 9. 0軟件。

2 結果與分析

2.1 Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲死亡情況的影響

重金屬處理的舞毒蛾幼蟲死亡率均為30%（表1）。

表 1 Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲死亡情況的影響Table 1 Effects of Mn2+ and Co2+ on the death of gypsy moth larvae

2.2 Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲體質量與營養取食的影響

重金屬處理的舞毒蛾幼蟲取食量、蟲糞量、體質量增長量均顯著低于對照組。相比對照組，Mn2+處理組取食量降低 80.06%，蟲糞量降低95.64%，體質量增長量降低203.94%；Co2+處理組取食量降低95.29%，蟲糞量降低90.26%，體質量增長量降低140.86%。表明Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲取食量、蟲糞量、體質量增長量均有顯著的抑制作用（圖1）。

2.3 Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲營養成分的影響

重金屬處理的舞毒蛾幼蟲可溶性蛋白含量、碳水化合物含量、海藻糖含量、脂質含量均顯著低于對照組。與對照組相比，Mn2+處理組可溶性蛋白含量降低33.76%，碳水化合物含量降低57.56%，海藻糖含量降低64.05%，脂質含量降低27.77%；Co2+處理組可溶性蛋白含量降低47.46%，碳水化合物含量降低59.45%，海藻糖含量降低59.16%，脂質含量降低33.71%。表明Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲可溶性蛋白含量、碳水化合物含量、海藻糖含量、脂質含量均有顯著的抑制作用（圖2）。

2.4 Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲總抗氧化力的影響

重金屬處理的舞毒蛾幼蟲總抗氧化力均顯著高于對照組。與對照組相比，Mn2+處理組總抗氧化力增加28.25%，Co2+處理組總抗氧化力增加82.54%。表明Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲總抗氧化力有顯著的促進作用（圖3）。

注：圖中*表示處理組與對照組存在顯著性差異，下同Note: * in the figure indicates that there is a significant difference between the treatment group and the control group，the same below

圖 2 Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲營養成分的影響Fig. 2 The effect of Mn2+ and Co2+ on nutritional composition of gypsy moth larvae

3 討論

環境中重金屬會對植物的生長發育產生不同程度的影響，可直接影響植物生長，也可通過影響土壤的生理特性進一步影響植物的生長發育[15]。舞毒蛾幼蟲作為雜食性昆蟲，主要以植物的葉片為食，但由于不同樹種葉片營養成分、吸收存儲重金屬離子能力存在差異[16]，同時舞毒蛾幼蟲對不同樹葉存在取食偏好性等原因[17]，采取不同樹葉進行研究容易攝入過多變量，導致難以分析食物中重金屬的含量對舞毒蛾幼蟲的影響。因此本實驗采用重金屬離子溶液配置的混合飼料飼喂舞毒蛾4齡幼蟲進行實驗。有研究表明在飼料中添加Cd2+顯著延長了舞毒蛾幼蟲的發育時間，并且顯著降低了其取食量和體質量增長量[18]，可能是因為舞毒蛾幼蟲的取食偏好性，對含重金屬的食物不喜歡所致。本研究發現舞毒蛾幼蟲的腸道受到嚴重的破壞，甚至溶解，說明很大的可能性是由于舞毒蛾幼蟲的腸道遭到了重金屬的破壞。Malakar C等人的研究也發現在Cd2+的脅迫作用下，短角稻蝗（Dnopherula brevicornis）幼蟲的日增重、生長速率和壽命會明顯降低[19]；與本實驗結果相吻合；表明很可能是因為重金屬本身對舞毒蛾幼蟲具有刺激作用。可溶性蛋白是重要的滲透調節物質和營養物質，其變化可以反映細胞內蛋白質的合成、變性和降解等重要信息[20]。有研究表明，重金屬如Pb等可通過與蛋白質的-SH或其它基團的相互作用，改變其結構或功能，進而影響其合成代謝[21]，這結果與本實驗結果相吻合，這可能是因為重金屬脅迫對蛋白質的合成具有一定的抑制作用，抑制了蛋白合成酶的活性。碳水化合物是昆蟲重要的能源物質，是維持其生命活動所需能量的主要來源[22]，研究表明，當舞毒蛾受到阿維·殺鈴脲復合劑脅迫時，體內碳水化合物含量會有所下降[23]；與本研究結果一致，說明重金屬脅迫可以抑制碳水化合物的轉化，使昆蟲正常的生命活動受到影響。海藻糖是昆蟲體內主要的糖類，脂質是其主要的儲能物質，研究表明，用添加了Cd2+的人工飼料飼養舞毒蛾幼蟲后，其組織和淋巴中的儲能物質海藻糖、糖原和脂質含量顯著下降[24]；與本實驗結果相一致，因此我們可以推測出舞毒蛾幼蟲為了緩解重金屬脅迫帶來的不良影響，可能會激發海藻糖酶和脂肪酶的活性，促使海藻糖分解為葡萄糖，脂質轉化為脂肪酸和甘油，為維持其正常的生長發育提供更多能量。總抗氧化力是用于評價機體抗氧化系統功能狀況的綜合性指標。它的大小可以從總體上反映機體防御體系抗氧化能力的高低[25]。研究表明，高濃度的Cd2+和Po2+脅迫會導致果蠅體內的總抗氧化力T-AOC，以及SOD和CAT的活性表現為抑制現象，且與脅迫的重金屬濃度相關[26]。本研究中發現舞毒蛾幼蟲在重金屬Mn2+和Co2+的脅迫作用下總抗氧化力顯著提高。其可能的原因是試驗濃度下Mn2+和Co2+毒力并未超過舞毒蛾4齡幼蟲抗氧化系統的承受能力，促使舞毒蛾幼蟲分泌各種抗氧化物質和抗氧化酶，從而提高它總抗氧力，以維持其正常生長發育。而高濃度的Cd2+和Po2+會導致果蠅的抗氧化系統破壞。說明昆蟲抗氧化系統抵御氧化脅迫的能力是有限的，低劑量的重金屬可以誘導蟲體抗氧化基因的表達，高劑量重金屬的持續脅迫則會造成抗氧化系統的破壞[27]。

圖 3 Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲總抗氧化力的影響Fig. 3 The effect of Mn2+ and Co2+ on the total antioxidant capacity of gypsy moth larvae

4 結論

重金屬Mn2+和Co2+對舞毒蛾幼蟲體質量、營養取食量、排便量、可溶性蛋白含量、碳水化合物含量、海藻糖含量、脂質含量均有顯著的抑制作用，但對總抗氧化力有顯著的促進作用。說明舞毒蛾幼蟲主要通過提高自身抗氧化力的來應對重金屬的脅迫，同時也提高自身對重金屬的抗性。