皺皮木瓜多糖提取分離及其生物活性研究進展

傅滟，任星宇，楊丹，鄧才富，羅舜，徐廣*

重慶市藥物種植研究所中藥材質量控制研究中心，重慶市道地藥材規范化生產工程技術研究中心（重慶 408435）

皺皮木瓜為貼梗海棠（Chɑenmeles speciosɑ Nakai）的干燥果實，主產于安徽宣城、重慶綦江以及湖北長陽資丘[1]。木瓜自古以來作為治病良藥，具有平肝舒筋、和胃化濕、降壓、降糖、軟化血管、護肝降酶、養顏抗衰、防老年癡呆、促進血液循環、延年益壽和提高人體免疫力等功效。作為藥食同源的常用中藥，含有多種對人體有益的營養成分和藥用成分，如多糖、有機酸、黃酮、皂苷、氨基酸、蛋白酶和維生素等[2-4]。

多糖又稱多聚糖，是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的，是具有廣泛生物活性的天然大分子化合物[5]，其廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物和動物體內。大量文獻研究表明，多糖具有多方面的生物活性與功能，具有清除自由基、降血糖、抗菌抗病毒、抗腫瘤與調節免疫等生物學功效[6-7]。近年來，多糖類物質的研究成為科學熱點[8-13]，研究多糖在食品、醫療、保健等領域的應用具有重要意義。

多糖為皺皮木瓜的重要成分，研究發現木瓜多糖具有很高的生物活性和藥用價值，可開發成功能性飲料、藥品和保健品。為皺皮木瓜的進一步研究奠定基礎，促進中國皺皮木瓜資源的開發利用，對皺皮木瓜多糖的提取、分離純化及其生物活性進行綜述。

1 皺皮木瓜多糖提取分離及純化

1.1 提取

多糖提取方法多樣，主要有浸提法、回流提取法、水提醇沉法、酶法、超聲波輔助、微波輔助、內部沸騰法、多種技術聯合使用等，其中水提醇沉法為木瓜多糖提取最常見方法之一。

楊之敏等[14]以石油醚回流脫脂，以固液比1︰30（g/mL）加入蒸餾水，90 ℃浸提2次，每次2 h，合并濾液濃縮，95%乙醇4 ℃過夜醇沉，再加入Sevag試劑（V氯仿︰V正丁醇=5︰1）除蛋白，用95%乙醇4 ℃過夜，抽濾，精制皺皮木瓜多糖得率3.4%。王曉梅等[15]采用水提醇沉法提取木瓜多糖：以乙醇回流脫脂，在提取溫度90 ℃，時間2.5 h，料液比1︰50（g/mL）條件下重復3次，加入Sevag試劑除蛋白，95%乙醇、丙酮反復精制，精制皺皮木瓜多糖提取率為6.97%。乙醇回流法，上述方法均具有操作繁瑣、耗時、試驗不易處理等缺點。

酶技術是近年來用于天然植物有效成分提取的生物工程技術，選用適當的酶可以比較溫和地分解植物組織，加速有效成分釋放，進而提高其提取率。陳燕等[16]采用纖維素酶法提取皺皮木瓜多糖，其通過正交試驗得其提取工藝：酶用量1.5%、提取溫度55 ℃、時間2 h、pH 4，多糖得率9.24%。同時對比不加酶、其他條件不變的情況下，多糖得率為5.23%；酶法較常規不加酶木瓜多糖的得率提高了76.67%。這可能是木瓜細胞壁的主要成分纖維素在提取過程中被纖維素酶軟化、膨脹和崩潰，從而促進了細胞的通透性，進而提高有效成分的提取量。但是酶容易失活，試驗溫度不能過高，對試驗有一定限制。

超聲或微波輔助提取技術已被廣泛用于植物有效活性成分的提取。超聲輔助提取多糖是一種物理破碎過程，利用其空化和機械振動作用破裂細胞壁，提高多糖提取率，同時還有熱效應和乳化作用，加速有效成分溶出。徐懷德等[17]采用超聲輔助提取木瓜多糖，在較短提取時間內，多糖提取率達到12.072%。黃鎖義等[18]以蒸餾水為提取劑，超聲提取皺皮木瓜多糖，多糖提取率達到12.81%。李寶珠等[19]采用二次回歸正交旋轉組合超聲輔助提取皺皮木瓜多糖，在較短提取時間內，多糖提取率達到16.5%。微波輔助提取技術既能保證有效物質的充分溶出，又能防止提取物的降解，對于一些物質的提取效果明顯優于其他方法。張彥慧等[20]采用響應曲面法微波輔助提取皺皮木瓜多糖，多糖平均提取率可達60.83±2.09 mg/g，比相同條件下傳統水浴平均提取率50.33±2.06 mg/g高出10.5%。

超聲和微波輔助提取技術相比于傳統水浴提取方法有明顯的優勢。提高多糖提取率，大大地縮短提取時間，提取工藝簡單，成本低。多種提取技術聯合使用是一大趨勢，超聲輔助聯合酶法、微波輔助聯合酶法或超聲微波同時輔助聯合酶法可能對于多糖的提取能開啟新的篇章。

1.2 分離純化

常用的提取方法所得木瓜多糖含有蛋白質、色素等物質，需進行分離純化。分離純化的方法有脫色、脫蛋白、大孔樹脂吸附法等。李芳等[21]利用Sevag法反復除去皺皮木瓜多糖中蛋白質，加入乙醇，使乙醇含量達80%，攪拌，4 ℃靜置過夜，抽濾，濾渣真空干燥，得精制多糖。王曉梅等[15]利用Sevag法多次除去木瓜多糖中蛋白質，采用多糖4倍量95%乙醇，收集沉淀，用乙醇、丙酮反復洗滌沉淀，真空干燥得精制木瓜多糖。劉捷等[22]利用Sevag法多次除去皺皮木瓜多糖中蛋白質，用透析法去除小分子雜質，利用Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱富集純化，得到精制木瓜多糖。姚程程等[23]利用Sevag法5次除去皺皮木瓜多糖中蛋白質，采用氧化法除色素，經大孔樹脂分離純化，多糖含量達89.74%。分離純化步驟冗長，耗時長，使用溶劑種類多、量大；亟需開發一種步驟簡便，耗時少，無溶劑或少溶劑的綠色可持續分離純化模式。王光寧等[24]采取星點設計-效應面法優選蛋白酶-Sevag法去除皺皮木瓜多糖中蛋白質，去除條件為：酶解pH 7，時間89 min，溫度54 ℃，酶底質量分數1.70%，Sevag法處理1次，多糖保留率70.04%，蛋白脫出率63.42%。該法步驟簡便，耗時少，大大減少有機溶劑使用。

2 生物活性

2.1 抗氧化活性

機體內自由基中危害極大的·OH，可引起細胞死亡、機體衰老等危害，亟待開發有抗氧化和清除·OH作用的、以天然物質為原料的產品。木瓜多糖具有很好的抗氧化、清除超氧自由基的作用。李南薇等[25]對皺皮木瓜葉多糖抗氧化活性進行研究，結果表明皺皮木瓜葉多糖具有較強清除DPPH·和·OH自由基的能力，其IC50分別為29和110 μg/mL。有報道從提取過綠原酸的木瓜濾渣中提取的多糖，對DPPH·和·OH自由基清除率分別達到28.78%和47.90%[20]。劉捷等[26]通過對木瓜多糖進行硫酸化的結構修飾，對其抗氧化能力進行考察，結果表明，硫酸化多糖清除超氧自由基的作用比未修飾的顯著增強，從30%顯著提升到57%。大量研究結果表明，木瓜多糖對超氧自由基清除能力顯著，且隨著多糖濃度增大，清除能力逐漸增大。木瓜多糖為3 mg/mL時，清除率達到81%。結果說明皺皮木瓜多糖對超氧自由基的清除率與多糖用量存在量效關系。

2.2 護肝活性

肝臟是人體內最大的實質性腺體，是體內新陳代謝的中心站。肝損傷是肝臟最常見的病例過程，由此引起的肝臟疾病如肝纖維化、肝硬化及肝腫瘤等嚴重危害人類健康。楊嬌嬌等[27]構建CCl4所致小鼠急性肝損傷模型，探討皺皮木瓜多糖對CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護作用；CCl4所致小鼠急性肝損傷，通過脂質過氧化產生過量自由基損傷肝細胞，導致試驗模型小鼠血清的ALT顯著升高，肝臟DMA含量增高和SOD含量明顯降低。結果表明，皺皮木瓜多糖能降低血清中ALT，提高肝細胞中的SOD、GSH、GSH-PX含量，降低MDA和NO含量；其作用機制可能是木瓜多糖能清除自由基、抑制過氧化反應、增加SOD活性、減少MDA生產、減少肝細胞破壞并促進其再生和修復。陳雪梅[28]構建CCl4所致小鼠急性肝損傷模型，觀察皺皮木瓜多糖對大鼠肝損傷中血清酶、蛋白合成能力的影響，探討木瓜多糖多肝損傷的保護作用及可能機制。結果表明，皺皮木瓜多糖能改善CCl4所致肝損傷，其機制可能與其增加自由基清除酶活力、清除輻射過程中脂質過氧化物的形成及降低TGF-β1mRNA的表達有關。

2.3 抗炎活性

李世剛等[29]建立小鼠佐劑性關節炎（AA）模型，檢測小鼠足爪的腫脹度，測定脾、胸腺、肝臟的指數，噻唑藍（MTT）法檢測脾淋巴細胞增殖反應，酶聯免疫（ELISA）法檢測脾細胞培養上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-4（IL-4）的水平，研究皺皮木瓜多糖對小鼠AA病理改變及炎癥因子表達的影響。結果表明：木瓜多糖對佐劑性關節炎具有明顯的治療作用，其原因可能是木瓜多糖對AA小鼠過高的脾淋巴細胞增殖反應有下調作用；另外，木瓜多糖可抑制TNF-α和IL-1β的產生，促進IL-4的表達，調節促炎和抗炎因子的表達，進而恢復細胞的網絡水平。薛丹[30]根據炎癥的不同時期表現，采用不同動物模型探討皺皮木瓜多糖的抗炎活性及機制。通過體外脂多糖LPS誘導巨噬細胞NR8383產生的體外炎癥模型，皺皮木瓜多糖顯著降低細胞上清炎癥因子TNF-α、IL-1β和COX-2及細胞內NO含量水平，且呈劑量依賴性。在試驗動物體內醋酸致毛細管通透性模型、紅細胞凝聚試驗模型和完全弗式佐劑模型中，皺皮木瓜多糖有較好的抗類風濕關節炎活性，其通過抑制免疫系統發揮作用。同時，皺皮木瓜各劑量組給藥后試驗動物體重未出現明顯降低，說明其在動物體內毒性較低。

2.4 抗凝血活性

血小板活化與聚集是導致血栓形成的重要因素。楊之敏等[31]以家兔建立模型，分空白組、阿司匹林組、皺皮木瓜多糖組（17，34和68 g/L）。分別研究木瓜多糖對膠原、花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）及凝血酶作用后血小板聚集的影響。通過監測誘導后血小板中5-羥色胺含量、肝素凝血酶凝固時間及血小板釋放丙二醛含量的變化，進而探討木瓜多糖抗凝血機制。結果表明，皺皮木瓜多糖可以抑制由膠原、花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）及凝血酶誘導的血小板聚集，其作用機制抑制家兔血小板5-羥色胺釋放，減少血栓素A2生成，達到抗血小板聚集、抑制血小板釋放血小板因子Ⅳ起到抗血小板聚集的目的。研究說明木瓜多糖通過抑制血小板釋放活性物質，具有明顯的抗凝血效果。

3 結語及展望

皺皮木瓜多糖在提取方法上以水提醇沉為主；微波、超聲和酶法等方法使其提取率提高，提取時間縮短，工藝簡單，成本低。傳統有機溶劑對皺皮木瓜多糖進行分離純化，同時許多新技術正運用于多糖的分離純化，如膜分離、大孔樹脂柱吸附、酶分離等。但提取分離、純化仍存在不足。同時多糖結構復雜，而皺皮木瓜多糖的結構未被完全表征，作用機制也還不明確，皺皮木瓜多糖的構效關系和量效關系及其生物活性需進一步研究。

皺皮木瓜多糖具有抗衰老、抗凝血、抗炎、護肝、抗病毒等作用，還是理想的免疫增強劑。通過對木瓜多糖的深入研究，可高效精確地發揮木瓜多糖的作用，在藥用開發的同時，還可以用于保健、飲品、大健康產業的發展。因此，皺皮木瓜多糖的研究，應從優化提取工藝、改進其分離純化方法出發，重點研究其結構、生物活性及其應用，在藥品、食品、保健品和化妝品多領域充分利用開發木瓜這一寶貴資源。皺皮木瓜多糖的研究對社會經濟、生活健康和木瓜產業具有重要意義。