龍膽苦苷對糖尿病周圍神經痛大鼠神經保護作用

魯義 姚嘉茵 王保 陳陳燕 勞俊銘 劉棟 堯新華

1廣州市中醫醫院麻醉科（廣州510130）；2中山大學附屬第六醫院（廣州510126）

糖尿病周圍神經痛（diabetic peripheral neurop?athy，DPN）以疼痛、感覺障礙、感覺喪失為特征，是糖尿病患者最為常見的并發癥［1-2］。其發病機制未完全明確，治療手段有限，是目前麻醉鎮痛領域中極具挑戰的研究［3-4］。龍膽苦苷是從中草藥龍膽草中分離得到的一種環烯醚類化合物。近年來國內外研究發現，龍膽苦苷（gentiopicroside，Gent）對中樞系統有一定的鎮痛作用，但機制不明確［5］。作者前期研究已成功通過四氧嘧啶鏈脲佐菌素（STZ）構建糖尿病神經痛大鼠動物模型［6-8］，并且證實龍膽苦苷對DPN大鼠模型有確證的鎮痛作用。然而，其鎮痛的機制尚不明確。神經傳導以及運動功能的有效實現依賴神經血流供應，糖尿病患者通常合并血脂代謝紊亂，血脂沉積在血管壁導致管腔狹窄，影響外周神經血供，從而影響神經功能。這是目前廣泛認可的血脂代謝在DPN致病中的作用，而PPAR?γ/AMPK/ACC是體內血脂代謝的重要信號通路。龍膽苦苷保護周圍神經的作用是否通過調節此通路影響血脂代謝而實現，這個問題亟需解答。因此，本研究將延續STZ誘導的DPN大鼠動物模型，以血脂代謝紊亂、神經傳導功能為切入點，探索營養神經血流以及其相關的PPAR?γ/AMPK/ACC信號通路的內在聯系，從而探討龍膽苦苷治療DPN的可能分子機制，為有效防治DPN提供新的理論和藥物新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠共45只（根據成組設計定量資料的樣本含量計算公式，計算出每實驗組需要大鼠15只），體質量180～220 g，稱重量后進行編號，隨機均分為3組，實驗分組如下：空白對照組（15只）；STZ誘導的DPN模型組（15只）；龍膽苦苷治療組（20 mg/kg·d Gent灌胃+STZ）（15只）。

1.2 實驗準備 采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ；Sigma，St.Louis，MO，USA）法構建DPN大鼠模型，禁食不禁水24 h，禁食12 h后按55 mg/kg腹腔注射STZ溶液。腹腔注射48 h后用血糖分析儀（北京中生生物）測定大鼠尾靜脈血糖>16.7 mmol/L的大鼠成為DPN大鼠模型，共得到30只DPN大鼠，全部大鼠造模成功。龍膽苦苷治療組在造模成功后給予龍膽苦苷20 mg/（kg·d）灌胃，大鼠劑量計算公式=（X mg/kg×70 kg×0.018）/0.2 kg=6.3 X mg/kg。X代表人體有效藥物劑量，70 kg是人的標準體質量，0.2 kg是大鼠的標準體質量，0.018是大鼠與人根據體表面積比的換算系數［9］。空白對照組則腹腔注射相同體積檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液，共得到15只。空白對照組以及DPN模型組大鼠均使用相同體積的生理鹽水灌胃處理。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 行為學分析 在造模后第1、7、14天，觀察3組大鼠有無自發性疼痛行為。內容包括歩態、抬腳、舔腳、腿著地性或抗重力行為、自殘等。

1.3.2 刺激試驗（1）熱輻射刺激。采用HARG?REAVES等［10］所描述的方法，在造模成功后第1、7、14天每組大鼠均接受熱輻射熱刺激試驗3次，間隔5 min，持續30 s。觀察并記錄大鼠后肢抬腳的潛伏期。（2）冷板試驗。在造模成功后第1、7、14天進行冷板試驗。使用JASMIN等［11］所描述的方法。冷板（PanlabHavard LE?7420，Spain）溫度為4℃。觀察并記錄大鼠足趾縮腿反應潛伏期，同時記錄5 min內總縮腿次數。（3）觸覺過敏試驗。在造模成功后第1、7、14天進行觸覺過敏試驗。將大鼠放置于鐵網上，下方使用Semmes?Weinstein Monofilaments A 835儀器（Sammons Preston，USA）代表不同壓力的Von Frey針刺激足底，使用DETLOFF等［12］所改良的上下調整法，記錄最小能誘發其縮腿的閾值。

1.3.3 激光多普勒血流儀檢測下肢血流 在造模后第14天采用多普勒激光測速儀（Perimed 5000，Sweden）檢測下肢血流。大鼠腹腔麻醉后，下肢剔毛，取其足踝內側上方2 cm處，測定血液灌注量（Perfusion，PU），每次連續測定5 min，得出PU平均值。

1.3.4 采集坐骨神經傳導速度 在使用激光多普勒血流儀檢測完下肢血流后直接手術分離坐骨神經。采用生物信號采集系統（Medlab?U/4C，USA）測定運動及感覺神經傳導速度。刺激點定位在坐骨結下0.5 cm，刺激強度從弱開始，緩慢增強到強刺激。計算復合動作電位出現的潛伏期與傳導距離的比值來表示神經傳導速度。

1.3.5 采用RT?PCR檢測PPAR?γ/AMPK/ACC信號通路各因子定位表達 完成以上實驗后，小心完整取出大鼠腰膨大組織，采用RT?PCR檢測各組大鼠腰膨大脊髓組織各因子表達的變化。采用Gel?Pro Analyzer 4.0軟件（Media Cybernetics，USA）根據電泳條帶的面積和亮度計算出每個條帶的積分光比值，該比值表示該細胞因子mRNA的相對表達水平。

1.4 統計學方法 數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，組間差異采用t檢驗分析，計數資料采用率表示，χ2檢驗分析組間差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學分析以及刺激試驗 造模后每天觀察各組大鼠行為學變化。在造模后第7天開始，DPN模型組大鼠比空白對照組和龍膽苦苷治療組大鼠顯得最為煩躁不安，少動，到第14天這種組間大鼠行為學差異尤為明顯。本研究進一步在造模后第7、14天采用刺激試驗量化各組大鼠的冷刺激、熱刺激以及機械刺激的疼痛閾值。結果提示，與對空白對照組相比較，DPN模型組以及龍膽苦苷治療組大鼠的冷刺激、熱刺激以及機械刺激的疼痛閾值明顯下降（P<0.05）；龍膽苦苷藥物干預后，各刺激試驗的疼痛閾值較DPN模型組升高，結果說明DPN大鼠存在痛覺過敏，而龍膽苦苷有效緩解疼痛，提高疼痛耐受閾值（圖1）。

2.2 各組大鼠血脂水平比較 DPN模型組大鼠總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）以及低密度脂蛋白（LDL）較空白對照組大鼠顯著升高（P<0.05）；低密度脂蛋白（HDL）較空白對照組下降（P<0.05）。結果提示DPN大鼠存在血脂代謝紊亂。龍膽苦苷干預后，有效下調TG、TC及LDL，上調HDL的水平（P<0.05）。龍膽苦苷有效糾正DPN大鼠的血脂代謝紊亂。見圖1。

圖1 各組大鼠血脂水平以及刺激試驗比較Fig.1 Blood fat level and stimulation tests in each group

2.3 各組大鼠下肢脛前動脈神經血流速度比較采用多普勒彩超評估營養神經的血流速度，結果提示，DPN模型組大鼠神經血流速度顯著下降，龍膽苦苷治療后神經血流速度較DPN模型組升高（表1）。大鼠神經傳導速度與營養神經的血流速度有顯著正相關性，龍膽苦苷有效增加神經血流速度，營養神經，從而改善神經傳導功能。

2.4 各組大鼠干預后坐骨神經運動與感覺傳導速度的比較 通過檢測運動以及感覺神經傳導速度，可以反應神經傳遞功能變化。結果顯示，DPN模型組大鼠不管感覺還是運動神經的傳導速度均較對照組明顯下降，存在神經功能損傷。龍膽苦苷干預后，感覺及運動神經的傳導速度較DPN模型組增加（P<0.05），但仍低于空白對照組（P<0.05，表1）。結果說明，龍膽苦苷一定程度上改善神經功能，但未能完全逆轉糖尿病周圍神經病變導致的神經損傷。

表1 各組大鼠神經血流速度、運動和感覺神經傳導速度的比較Tab.1 Blood flow velocity，motor and sensory nerve conduction velocity in each group ±s

表1 各組大鼠神經血流速度、運動和感覺神經傳導速度的比較Tab.1 Blood flow velocity，motor and sensory nerve conduction velocity in each group ±s

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

神經血流速度運動神經傳導速度感覺神經傳導速度空白對照組181.46±14.84#58.4±8.34#42.73±3.30#DPN模型組63.66±10.49*40.73±3.15*16.40±2.35*龍膽苦苷治療組166.00±11.27*#50.67±9.91*#38.20±4.18*#

2.5 各組大鼠腰膨大脊髓組織PPAR?γ/AMPK/ACC各因子表達的變化 采用RT?PCR檢測大鼠脊髓組織PPAR?γ/AMPK/ACC各因子基因表達量的變化。結果顯示，DPN模型組大鼠PPAR?γ與AMPK表達量較對照組下降，而ACC表達量較對照組升高（P<0.05）。龍膽苦苷治療組大鼠PPAR?γ與AMPK表達量較DPN模型組升高，而ACC表達量較DPN模型組下降。其中，龍膽苦苷組大鼠ACC表達量高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05，圖2）。

圖2 各組大鼠腰膨大脊髓組織PPAR?γ/AMPK/ACC各因子表達的變化Fig.2 Expression of genes in PPAR?γ/AMPK/ACC signaling pathway in each group

3 討論

DPN對于患病時間較長的糖尿病患者而言，是最為常見并發癥［13］。根據KISOZI等［14］報道，50%以上的糖尿病患者會出現周圍神經病變，主要表現為下肢疼痛、肢端麻木，極大地影響糖尿病患者的生存質量，部分患者因為長期慢性疼痛的刺激與困擾甚至會出現失眠、抑郁，耗費大量的醫療與社會資源。因此，預防以及治療DPN是麻醉鎮痛領域中的新挑戰。

目前DPN的發病機制尚不明確，慢性高血糖、繼發血脂代謝紊亂以及由此導致的無菌性慢性炎癥導致外周神經的功能障礙是DPN致病的重要因素［15］。近年來，國內外研究的熱點更為關注神經損傷本身［16-17］。外周神經的兩大功能包括感覺傳導以及運動傳導功能的正常運作是基于神經結構以及血流供應正常的情況下實現的。但長期高血糖、血脂紊亂導致營養神經的血管管腔脂質沉積，管腔變窄，神經血流速度變慢，從而影響神經的血供，導致神經功能障礙［18-20］。本研究從最新的血脂代謝紊亂、神經血供角度，探索DPN的致病機制。結果提示，DPN模型大鼠的確存在顯著的血脂代謝紊亂以及神經功能異常，表現為感覺傳導速度以及運動傳導速度顯著下降，與行為學和刺激實驗的結果相符合。筆者進一步通過多普勒彩超監測神經血流速度，結果顯示DPN模型大鼠下肢脛前動脈神經血流速度下降，與神經功能障礙成顯著相關性，從而驗證了神經血流速度與神經功能的關系，與國外研究結果一致。

DPN的有效治療藥物非常有限。臨床常用的藥物包括抗抑郁藥、抗驚厥藥、抗痙攣藥，但上述藥物都具有一定的毒副作用，而且緩解疼痛的效果欠佳，限制了其在臨床的廣泛應用。由于缺乏有效的藥物，大約有50%～60%的患者最終被迫選擇了神經離斷術以緩解疼痛。近年來，隨著祖國醫學的進一步發展，中醫中藥在治療疼痛痹癥上取得明顯突破［21］。基于“消渴痹證”、“血痹”、“厥證”等理念，中醫在治療DPN上多以活血化瘀、健脾補腎、益氣養陰等治療手段。龍膽苦苷是龍膽瀉肝湯的主要活性成分，而且其化學結構已經明確。本鎮痛研究中心既往研究數據顯示，龍膽苦苷對DPN患者有治療作用。本文進一步采用龍膽苦苷干預DPN大鼠模型，結果發現，龍膽苦苷有效改善DPN大鼠外周神經的運動以及感覺傳導功能，增加冷熱刺激以及機械刺激的疼痛閾值，有效發揮鎮痛作用。

然而龍膽苦苷的治療DPN的分子機制仍未明確，本文結果提示龍膽苦苷治療組大鼠的外周神經血流速度較DPN模型組增加，通過改善神經血供實現神經保護作用可能是龍膽苦苷的治療機制。既然血脂代謝紊亂導致血管脂質沉積會直接影響血管管腔直徑，乃至血流速度的變化，本研究進一步從血脂代謝的分子機制探索龍膽苦苷的神經保護作用。PPAR?γ/AMPK/ACC信號通路是比較成熟的血脂代謝通路。PPAR?γ通過促進AMPK，抑制ACC共同調節血脂代謝平衡。已有研究報道，糖尿病患者存在胰島素抵抗，PPAR?γ表達量顯著下降，使用羅格列酮，PPAR?γ的激動劑可以有效改善胰島素抵抗，同時改善血脂紊亂［22］。本研究結果表明，龍膽苦苷藥物干預可以促進腰膨大脊髓組織中PPAR?γ以及下游AMPK的基因表達，抑制ACC的基因表達，起到與羅格列酮相類似的作用。因此，龍膽苦苷對DPN大鼠的神經保護作用可能是通過PPAR?γ/AMPK/ACC信號通路介導。

本研究存在一定的局限性，對于PPAR?γ/AMPK/ACC信號通路的研究僅局限在基因水平。因此，未來將進一步深入研究，完善信號通路蛋白水平的檢測，開展離體細胞實驗，通過添加PPAR?γ、AMPK、ACC各自的激動劑與抑制劑深入探索信號通路的內在關系。本研究結果表明龍膽苦苷可有效治療DPN大鼠模型，其神經保護機制可能是通過調節PPAR?γ/AMPK/ACC信號通路，維持血脂代謝平衡，增加營養神經血流而實現的。