瘦素、IL?18、NLRP3與高血壓性腦出血嚴重程度、預后的關系及其在預后評估中的價值

李改 胡兵 張會敏

1河南南陽南石醫院檢驗科（河南南陽473000）；2新鄉醫學院（河南新鄉453000）

高血壓性腦出血（HICH）屬于臨床危重癥，發病率高，占全部腦出血類型的70%左右［1］，致死致殘率高，預后差，嚴重威脅人類的生命健康。近年來，臨床常采用評分量表預測HICH患者預后，但仍缺乏準確可靠的實驗室預測指標。病理生理研究表明［2］，HICH發病過程涉及炎癥、氧化應激、細胞凋亡等多種機制，其中炎癥反應與急性腦損傷及預后關系密切。已有研究證實［3］，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）的激活可介導白介素-18（IL?18），從而參與炎癥反應，進而損傷腦組織。瘦素是一種分泌型多肽，結構與IL?18、IL?6等相似，屬于細胞因子，在多種炎性疾病中均有重要生物學效應［4］。上述研究均提示瘦素、IL?18、NLRP3均參與炎癥反應，與腦出血病情嚴重程度有關，但關于三者在HICH預后評估中應用較少，因此，了解HICH后炎癥相關因子瘦素、IL?18、NLRP3的表達與疾病嚴重程度及預后的關系，對指導臨床治療及改善預后有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用前瞻性隨機對照研究方法，選取2018年1-12月醫院收治的132例HICH患者，設為疾病組，其中男79例，女53例；年齡35～79歲，平均（58.50±6.41）歲；高血壓病程1～20年，平均（8.50±1.34）年；發病至手術時間1～24 h，平均（15.71±2.14）h；出血部位：皮質33例，基底節69例，丘腦17例，小腦13例；出血量10～85 mL，平均（32.17±5.10）mL；入院高血壓分級［5］：Ⅰ級29例，Ⅱ級66例，Ⅲ級37例；入院格拉斯哥昏迷（GCS）評分［6］：13～15分60例，9～12分44例，≤8分28例；臨床神經功能缺損程度［7］：輕型62例，中型44例，重型26例；合并糖尿病29例；手術方式：小骨窗開顱術37例，骨瓣開顱血腫清除術65例，腦室外引流術30例；同時選取同時期體檢中心收入的50例健康受試者，設為健康組，男30例，女20例；年齡35～75歲，平均（57.83±6.24）歲；疾病組和健康組性別構成比、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。納入標準：（1）疾病組均符合HICH診斷標準［8］，且經顱腦影像學證實、首發病例、均接受手術治療；（2）健康組經體檢合格；（3）均簽署知情同意書；排除標準：（1）疾病組排除動靜脈畸形、顱腦內腫瘤等其他原因引起的出血；（2）疾病組排除腦干出血、雙側腦疝等；（3）均合并機體重要臟器功能嚴重不全者；（4）健康組排除心血管、內分泌系統疾病或骨關節病者。本次研究獲得醫院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 瘦素、IL?18檢測 收集患者入院24 h內及健康受試者空腹靜脈血3 mL（不含抗凝劑的真空采血管），靜止自然分層后，2 800 r/min離心10 min，收集上層血清，應用瘦素酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒、IL?18 ELISA試劑盒（上海康朗生物科技有限公司）檢測血清瘦素、IL?18水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，于酶標儀下測定吸光光度值，并根據標準曲線計算樣本濃度。

1.2.2 NLRP3 mRNA表達檢測 采用含乙二胺四乙酸（EDTA）的真空采血管，采集疾病組和健康組受試者空腹靜脈血5 mL，2 800 r/min離心10 min，收集上層血漿1 mL，加入等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，加入2 mL淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心20 min，取第二層液體，即為外周血單個核細胞（PBMCs），PBS重懸再次離心2次，取下層沉淀；沉淀采用Trizol法提取總核糖核酸（RNA），逆轉錄獲得互補鏈脫氧核糖核酸（cDNA），然后應用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TakaRa公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT?qPCR），按照試劑盒說明書設定反應體系，以β?actin為管家基因，2?△△CT為目的基因的相對表達強度，所有實驗重復3次取Ct平均值。

1.2.3 預后判定 患者入院后確診為HICH 6個月后，以復診或電話方式隨訪，采用格拉斯哥預后（GOS）評分［9］評估患者預后情況，預后共分5級：5級為恢復良好，有輕度缺陷但可正常生活；4級為輕度殘疾，但可獨立生活或保護下工作；3級為重度殘疾，神志清醒但不能獨立生活；2級為植物生存；1級為死亡。1～3級為預后不良，4～5級為預后良好。

1.2.4 臨床資料調查及危險因素賦值 根據預后情況將患者分為預后良好組和預后不良組，收集2組臨床資料，包括性別、年齡、高血壓病程、發病至手術時間、神經功能缺損程度、出血部位、是否破入腦室、出血量、入院高血壓分級、GCS評分、是否合并糖尿病、手術方式及外周血瘦素、IL?18、NLRP3 mRNA相對表達量。將上述可能導致預后不良的因素進行賦值，并以之為自變量，以預后是否不良（否=0、是=1）為因變量進行Logistic回歸分析（表1）。

1.3 統計學方法 SPSS 24.0處理數據，計量資料均用表示，兩兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗；多樣本計量資料比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK?q檢驗；計數資料用［例（%）］表示并用檢驗，等級計數資料用秩和檢驗；應用Logistic回歸分析法分析導致預后不良危險因素的比值比（odds ratio，OR）及95%置信區間（confidence interval，CI）。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 Logistic回歸分析賦值Tab.1 Logistic regression analysis assignments

2 結果

2.1 健康組和不同嚴重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對比 健康組、不同嚴重程度疾病組外周血瘦素、IL?18、NLRP3比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同嚴重程度疾病組外周血瘦素、IL?18、NLRP3均高于健康組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且重型組大于輕型和中型組，中型組大于輕型組，差異均有統計學意義（P＜0.05，表2）。2.2 預后良好組和預后不良組瘦素、IL?18、NL?RP3對比 預后良好率為68.18%（90/132）；預后不良組瘦素、IL?18、NLRP3均高于預后良好組，差異均有統計學意義（P＜0.05，表3）。

2.3 預后良好組和預后不良組可能影響因素的差異對比 預后不良組性別、高血壓病程、發病至手術時間、出血部位、入院高血壓分級、合并糖尿病、不同手術方式患者構成比比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；預后不良組年齡＞60歲、重型神經功能缺損、破入腦室、出血量＞30 mL、入院GCS評分≤8分患者構成比均高于預后良好組，差異均有統計學意義（P＜0.05，表4）。

2.4 Logistic回歸分析法分析導致預后不良的危險因素 經Logistic回歸分析，年齡＞60歲、破入腦室、出血量＞30 mL、瘦素＞16.2 ng/mL、IL?18＞220 ng/L、NLRP3 mRNA相對表達量＞3.1、重型神經功能缺損、入院GCS評分≤8分均是導致預后不良的危險因素（P＜0.05，表5）。

表2 健康組和不同嚴重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對比Tab.2 Comparison of leptin，IL?18，NLRP3 in healthy groups and patients with different severity ±s

表2 健康組和不同嚴重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對比Tab.2 Comparison of leptin，IL?18，NLRP3 in healthy groups and patients with different severity ±s

注：與健康組比，*P＜0.05；與輕型比，△P＜0.05；與中型比，▲P＜0.05

組別健康組疾病組輕型中型重型F值P值例數50 62 44 26瘦素（ng/mL）4.12±0.80 10.09±2.12*28.62±5.37*△48.44±7.21*△▲887.058<0.001 IL-18（ng/L）80.05±9.31 167.19±23.02*242.42±32.18*△361.08±55.82*△▲566.643<0.001 NLRP3 mRNA相對表達量1.01±0.12 2.35±0.26*3.01±0.45*△4.28±0.59*△▲546.861<0.001

表3 不同嚴重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對比Tab.3 Comparison of leptin，IL?18，NLRP3 in patients with different severity ±s

表3 不同嚴重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對比Tab.3 Comparison of leptin，IL?18，NLRP3 in patients with different severity ±s

組別預后良好組預后不良組t值P值例數90 42瘦素（ng/mL）15.70±2.06 46.12±6.95 38.222<0.001 IL?18（ng/L）202.18±25.44 291.05±30.18 17.598<0.001 NLRP3 mRNA相對表達量2.71±0.30 3.46±0.42 11.721<0.001

2.5 瘦素、IL?18、NLRP3對預后不良的預測效果分析 ROC結果顯示，瘦素、IL?18、NLRP3對預后不良預測最佳截斷點分別為41.7、265.4 ng/L、3.3，AUC分別為0.755、0.801、0.852（表6、圖1）。

圖1 瘦素、IL?18、NLRP3預測預后不良ROC曲線Fig.1 ROC curves of poor prognosis predicted by leptin，IL?18，and NLRP3

表4 預后良好組和預后不良組可能影響因素的差異對比Tab.4 Comparison of possible influencing factors between good prognosis group and poor prognosis group 例（%）

表5 Logistic回歸分析法分析導致預后不良的危險因素Tab.5 Analysis of risk factors leading to poor prognosis by Logistic regression analysis

表6 瘦素、IL?18、NLRP3對預后不良的預測效果分析Tab.6 Prediction effect analysis of leptin，IL?18，NLRP3 on poor prognosis

3 討論

HICH是由高血壓引發的源于腦實質的顱內出血，具有起病急、病情復雜、進展迅速等特點，在給予及時有效的治療措施的同時，尋找可靠的實驗室指標對預后做出客觀和準確的評估，對患者治療策略的調整有重要意義。高血壓和腦動脈粥樣硬化是導致HICH首要原因［10-11］，血壓驟升導致腦動脈破裂，隨之血腫形成及血腫占位效應可直接和繼發性損傷腦組織，一方面，腦出血后補體、凝血酶等血腫成分直接損傷腦細胞；另一方面血腫占位效應可激活周圍血管系統的防御反應及全身系統炎癥反應，以及時清除細胞碎片及凋亡細胞。繼發性腦損傷是影響HICH預后的關鍵，而炎癥反應是繼發損傷的重要部分［12-13］。因此，本研究對既往收治的HICH患者的臨床資料進行回顧，通過分析瘦素、IL?18、NLRP3在外周血中的表達情況，重點分析其與預后的關系，探討其在HICH預后評估中的價值。

本研究發現，不同嚴重程度疾病組外周血瘦素、IL?18、NLRP3均高于健康組，且重型組大于輕型和中型組，中型組大于輕型組，提示外周血瘦素、IL?18、NLRP3與HICH患者病情嚴重程度關系密切。瘦素主要由脂肪細胞分泌，研究表明，中樞系統中廣泛存在瘦素受體，HICH后機體處于應激狀態，脂肪細胞大量合成和釋放，導致外周血中瘦素水平升高，瘦素可通過血腦屏障與瘦素受體結合，通過下丘腦-神經肽通過參與病情進展［14］。另有研究證實［15］，瘦素是導致HICH發病的危險因素，主要通過激活交感神經系統、促進脂肪細胞血管緊張素原表達、與血管內皮細胞中瘦素受體結合改變血管張力等途徑引起血壓升高，參與HICH發生、發展。本研究中HICH患者外周血瘦素水平隨病情嚴重程度加重而升高，提示瘦素水平與HICH病情嚴重程度有關。NLRP3是廣泛分布于細胞質中的感受器蛋白，當識別危險信號時，其蛋白結構改變，與銜接蛋白（ASC）、效應蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶1前體（Pro?caspase1）組成蛋白復合物，即炎癥小體，激活的炎癥小體通過促進IL?18合成和分泌，誘導細胞程序性死亡［16-17］。高血壓和腦動脈粥樣硬化導致的腦出血發生后，NLRP3炎癥小體激活，內皮細胞、腦膠質細胞合成和分泌大量IL?18，IL?18可破壞血腦屏障進入外周血，加速細胞程序性死亡過程，病情加重。

此外，本研究中，預后不良組年齡＞60歲、重型神經功能缺損、破入腦室、出血量＞30 mL、入院GCS評分≤8分患者構成比、瘦素、IL?18、NLRP3均高于預后良好組，且經Logistic回歸分析證實均是導致預后不良的危險因素，提示瘦素、IL?18、NL?RP3是HICH預后不良的危險因素。瘦素最初常作為調節能量消耗的激素，與肥胖關系密切［18-19］，隨著研究的深入，發現瘦素參與多系統功能調節。BOUZIANA等研究發現［20］，腦卒中患者外周血瘦素水平異常較高，且與病灶大小、GCS評分關系密切，本研究采用回歸分析證實瘦素是HICH預后不良的危險因素，應用ROC曲線判定預后不良瘦素最佳截斷點為41.7 ng/mL，并在預測6個月預后時呈現出較高的靈敏度和特異度，提示瘦素在HICH預后評估中較高的應用價值。HICH后繼發性神經炎癥反應可導致腦細胞損傷，增加腦水腫等并發癥發生風險。研究表明［21］，HICH后早期腦血腫周圍組織內NLRP3信號通路處于激活狀態，促進其下游IL?18的合成和釋放，且通過參與補體誘導的神經炎癥反應，加重腦損傷，增加遲發性腦損傷風險，不利于預后神經功能恢復。本研究ROC曲線辨別外周血IL?18、NLRP3最佳截斷點分別為265.4 ng/L、3.3，HICH預后不良AUC分別為0.801、0.852，說明IL?18、NLRP3在HICH預后評估中有重要應用價值，可作為HICH預后評價的實驗室指標。

綜上所述，外周血瘦素、IL?18、NLRP3與HICH患者病情嚴重程度有關，有助于早期判斷HICH患者的預后，在預后評估中有重要應用價值，提示臨床中應加強HICH患者外周血瘦素、IL?18、NLRP3水平的檢測，并及時實施有效治療策略，以期最大限度改善患者預后。本研究不足之處在于納入樣本量較少，且由于研究成本的局限性，僅開展了單中心研究，在進一步的研究中應擴大樣本量并開展多中心、前瞻性研究，為本研究結論提供更充分的數據支持。