聽覺剝奪對成年雄性斑胸草雀鳴唱行為和LMAN核團的影響

劉鐘澤，孫穎郁，張信文，楊思遠

（1.熱帶島嶼生態學教育部重點實驗室，海南師范大學 生命科學學院，海南 海口 571158；2.海南科技職業大學，海南 海口 571126；3.北京師范大學 生命科學學院，北京 100875）

自然界中許多動物可以通過聲音進行交流，例如鯨，蝙蝠等[1]，但這些發聲行為并不是通過學習產生的。鳴禽是除了人類以外極少具有發聲學習能力的動物，鳥類具有鳴叫（call）和鳴唱（sing）兩種發聲行為，其叫聲中包含有豐富的生物學信息，被用來進行個體及種群之間的識別、求偶、覓食、報警、筑巢等活動，被稱為鳥類的語言[2]。與人類的語言相似，鳴禽的鳴唱是一種依賴于聽覺反饋的后天習得發聲行為。幼鳥如果錯過了學習鳴唱的特定時期，成年之后可能出現鳴唱障礙，成年雄鳥仍需聽覺反饋維持其結晶化鳴唱。所以，鳴禽作為研究感覺與運動信息整合的模型，其鳴唱行為的學習過程和神經控制機制與人類具有相似性[3]，研究鳴禽發聲控制中樞可塑性對于揭示人類語言學習的神經機制具有重要意義。

斑胸草雀（Taeniopygia guttata）作為模式動物，被廣泛用于習得發聲行為的研究，其鳴唱系統是由腦中一系列不同水平、界限清楚且離散分布的特定核團構成的神經通路[4]。發聲運動通路（Vocal Motor Pathway，VMP）由端腦的高級發聲中樞（High Vocal Control Center，HVC）投射神經纖維下行經過古紋狀體櫟核（Robustus Archistriatalis，RA）最后投射到延髓，通過低位運動中樞舌下神經核鳴管支nXIIts核團支配鳴肌從而控制發聲。發聲學習通路（Anterior Forebrain Pathway，AFP）是從HVC投射神經纖維經過前腦X區（Area X）、丘腦背外側核內側部DLM（Medial portion of the dorsolateral nucleus of the anterior thalamus）、新紋狀體前部巨細胞核外側部（Lateral portion of the Magnocellular nucleus of the Anterior NeostriatumLMAN），最后至RA 形成的環路，主要參與鳴唱可塑性[5-9]。

LMAN核團是AFP通路的最后一個輸出核團，很可能與鳴唱的學習和鳴曲可塑性有關[10]。幼年時期損毀LMAN核團會使鳴唱提前穩定（Crystallization），從而阻斷鳴唱學習[11]。成年時期損毀LMAN核團短期內幾乎不影響其鳴曲結構，但在致聾前損毀LMAN核團，可以有效阻止鳴唱的退化[12]。然而在成年致聾斑胸草雀的鳴唱退化過程中，致聾對LMAN的影響和LMAN核團的工作機制仍不完全清楚。因此，本實驗旨在通過對成年雄性斑胸草雀進行聽覺剝奪，檢測鳴禽鳴唱行為以及腦內LMAN核團的變化，探究LMAN核團在鳴禽發聲系統中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選擇8只鳴唱較好的成年雄性斑胸草雀（＞90 PHD）為實驗動物，4只為對照組，4只為致聾組。實驗動物的使用符合國家和學校動物倫理委員會規定并遵守國際慣例。整個實驗過程中，所有的實驗動物養育在同一環境，并保持致聾組手術后14 d內連續錄音。

0.96%戊巴比妥鈉，20%氨基甲酸乙酯，4%多聚甲醛（PFA），NaCl，0.2 mol/L 磷酸緩沖液（PB，pH 7.4），無水乙醇，二甲苯，0.1%焦油紫染液，Enpon812中性樹膠等均購自北京化學試劑公司。

1.1.3 儀器

電子天平，Sartorius AL104；低溫恒冷切片機，Leica CM1850；體視鏡及冷光源，北京市科儀電光儀器廠XTT-AB；錄音聲卡，Focusrite Scarlett 2i4；恒流泵，保定蘭格恒流原有限公司，BT50-1J；光學顯微鏡及攝像系統，Olympus CX31；倒置熒光顯微鏡，Zeiss ObserverZ1。

1.2 方法

1.2.1 聽覺剝奪手術

實驗動物斷水斷食1 h后，胸大肌注射戊巴比妥鈉（0.5 g/kg）進行麻醉，剝離雙側耳蝸致聾，在顯微鏡下觀察剝離的雙側耳蝸是否完整。對照組進行假手術，采用與致聾組相同的麻醉過程，也將表面皮膚剪開，但不將鼓膜捅破，也不將耳蝸拔除，進行假手術的目的是為了避免手術本身對實驗結果的影響。術后確保手術鳥處在清潔和溫暖的環境中，供給足夠的食物和清水，對照組與致聾組手術后在同一環境連續養育14 d。

1.2.2 灌流與切片

致聾組與對照組手術后在同一環境連續養育14 d后，胸大肌注射氨基甲酸乙酯（2.5 g/kg）進行麻醉，使用恒流泵以22 rpm流速向左心室中泵入4%多聚甲醛溶液固定5 min，隨后剪下頭部，剝離全腦并將其置于4%多聚甲醛溶液中固定6 h，再轉移到30%蔗糖溶液中4 ℃過夜至腦沉底。利用低溫恒冷切片機冠狀切片，片厚為10 μm，平行取6套（平行切取6片后舍棄6片，再平行切取6片），-20 ℃保存。

1.2.3 焦油紫染色

設計意圖：通過討論與交流，學生逐漸形成基于事實證據，分析生物規律，理解生命本質的科學思維。教師充分利用實驗資料，在學生原有認知上挖掘深層知識，初步滲透科學探究的方法教育。

上述切片在0.1%焦油紫染液中孵育7 min后，在70%乙醇中浸泡3 min。接著用95%乙醇浸泡兩次，每次1 min。然后用100%乙醇浸泡三次，每次1 min。最后用二甲苯處理兩次，每次5 min，中性樹膠封片。

1.2.4 NeuN免疫組織化學標記

將1.2.2節得到的切片在0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。然后在3%正常羊血清（0.5%TritonX-100/PBS 稀釋，ZLI-9021，Jackson）室溫封閉30 min；最后用一抗小鼠抗NeuN 抗體（1∶400，MAB377，Millipore），4 ℃孵育過夜。次日將切片在室溫中再孵育2 h；用0.01 mol/L PBS 漂洗3 次，每次5 min；然后用二抗Alexa fluor 488標記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶200，A11005，Invitrogen）在室溫孵育2 h；最后用0.01 mol/L PBS漂洗5次，每次5 min；用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.5 聲譜分析

雄性斑胸草雀的鳴曲由重復出現的短語組成，每個短語包含多個按照一定順序排列的音節。使用Sound Analysis Pro（SAP 2011）軟件錄制和分析斑胸草雀的鳴曲。手術前后，選取鳴曲中同一個短語作為檢測對象，每只動物統計處死當天和手術前兩天的鳴曲，每天統計30 個該重復短語，分析每個音節平均熵值（Mean Entropy）和熵值變異數（Entopy Variance）等參數。

1.2.6 核團面積和體積分析

采用Olympus顯微鏡觀察經焦油紫染色的雄性斑胸草雀腦切片并采集LMAN核團圖像。LMAN核團的邊界在4倍物鏡下清晰可見，用ImageJ 12.0軟件統計核團面積。LMAN 核團體積用切片上LMAN 核團的平均面積與切片數的乘積表示[13]，即V = S·N·h，其中，V為LMAN核團的體積（mm3）；S為切片上LMAN核團的平均面積（mm2）；h為一套切片上相鄰腦片間的距離（120 μm）；N為一套切片上含有LMAN核團的腦片總數。

1.2.7 核團神經元面密度分析

采用Zeiss 倒置熒光顯微鏡對經NeuN 免疫組織化學標記的雄性斑胸草雀腦切片進行拼圖拍照，采集LMAN核團圖像。LMAN核團內神經元在20倍物鏡下清晰可見，用Adobe Photoshop軟件對核團內神經元進行3個100 μm×100 μm視野的取樣統計，獲得NeuN免疫組織化學標記下LMAN核團神經元面密度的數據。

1.2.8 統計分析

應用SPSS 12.0（SPSS，Chicago，IL）和Graphpad prism 5.0（Graphpad Software，San Diego，CA）軟件進行數據分析。用獨立樣本t檢驗分析致聾前后鳴唱音節參數、LMAN核團平均面積和體積以及神經元面密度的差異性。

2 結果與分析

2.1 聽覺剝奪引起成年雄性斑胸草雀鳴唱行為的退化

聲譜分析結果（見圖1）顯示，對照組動物手術前后音節結構保持不變（左列），而致聾組動物手術前后短語和音節結構發生顯著變化（右列），鳴曲聲譜結構發生了顯著畸變和短語丟失。

2.2 聽覺剝奪前后成年雄性斑胸草雀音節參數的變化

為了檢測致聾對鳴唱行為的影響，本研究分析了致聾前后音節平均熵值和熵值變異數的變化，結果見圖2。與對照組相比，致聾組手術后14 d 音節平均熵值與基線的百分比顯著減小（P ＜0.05）（對照組為104.39±1.91%，致聾組為94.49±3.14%），熵值變異數與基線的百分比顯著減小（P ＜0.05）（對照組為88.63±3.94%，致聾組為75.03±2.98%）。

2.3 聽覺剝奪誘導成年雄性斑胸草雀LMAN核團平均面積和體積的變化

圖1 對照組和致聾組實驗鳥手術前后鳴曲聲譜結構的變化Figure 1 Changes of the sonographic structure of song in control group and deafening group before and after surgery

圖2 致聾前后熵值和熵值變異數的定量分析Figure 2 Quantitative analysis of entropy and entropy variance before and after deafness

焦油紫染色結果顯示，LMAN核團染色較深，邊界清晰，胞體清晰可見，多為梭形、多角形或橢圓形，如圖3 所示。圖4（A）可以看出，對照組LMAN 核團的平均面積為（0.0681±0.0012）mm2，致聾組LMAN 核團的平均面積為（0.0621±0.0011）mm2，顯示致聾組切片上LMAN核團的平均面積有明顯減小的趨勢（與對照組相比），數據統計有顯著性差異（P ＜0.05）。LMAN核團體積在致聾前后的變化如圖4（B）所示，對照組LMAN核團體積為（0.0629±0.0011）mm3，致聾組LMAN核團體積為（0.0549±0.0014）mm3，表明致聾組LMAN核團的體積與對照組相比也存在明顯減小的趨勢，數據統計有顯著性差異（P ＜0.05）。

圖3 聽覺剝奪對LMAN核團橫截面積的影響Figure 3 Effects of auditory deprivation on the cross-sectional area of the LMAN nucleus

2.4 聽覺剝奪誘導成年雄性斑胸草雀LMAN核團神經元面密度的變化

圖4 致聾前后LMAN核團平均面積和體積的比較Figure 4 Comparison of the mean area and volume of LMAN nuclei before and after deafness

NeuN免疫組織化學標記結果顯示，LMAN核團染色特異性較低，邊界不清晰，因此使用Adobe Photoshop軟件對LMAN 核團內細胞進行100 μm × 100 μm 3 個視野的取樣統計，獲得NeuN 免疫組織化學標記下LMAN核團內細胞面密度的數據，可以看到在100 μm×100 μm的取樣統計視野中，LMAN核團內細胞的胞體清晰可見，便于統計，如圖5所示。應用SPSS 12.0（SPSS，Chicago，IL）和Graphpad prism5.0（Graphpad Software，San Diego，CA）軟件對LMAN 核團內細胞面密度進行數據分析，結果（見圖6）顯示，對照組LMAN 核團內的細胞面密度為（16.24±0.18）個/0.01 mm2，致聾組LMAN 核團內的細胞面密度為（12.18±0.16）個/0.01 mm2，致聾前后LMAN核團內的細胞面密度存在差異。與對照組相比，致聾組LMAN核團內的細胞面密度明顯較小，數據統計具有顯著性差異（P ＜0.05）。

圖5 聽覺剝奪對LMAN核團內細胞面密度的影響Figure 5 Effects of auditory deprivation on the cellular surface density in LMAN nuclei

圖6 致聾組與對照組LMAN核團內細胞面密度的比較Figure 6 Comparison of cellular surface density before and after deafness in LMAN nuclei

3 討論

已有學者研究表明，幼年斑胸草雀在受到噪音等異常的聽覺干擾時，鳴曲結構（syllable structure）或序列（syllable sequence）會發生明顯的變化，但這些變化是可逆的，去除異常噪音反饋后鳴曲的音節結構或音節序列可恢復到正常水平[14]，聽覺反饋在鳴曲產生和學習過程發揮主要作用。本實驗中，成年雄性斑胸草雀在聽覺剝奪手術后14 d，鳴唱行為發生了顯著的變化，音節參數方面主要表現為熵值和熵值變異數與基線的百分比明顯減小。熵是熱力學中表征物質狀態的參量之一，因此熵值是衡量鳴曲結構混亂程度的重要音節參數。致聾14 d后熵值顯著增大[8]，說明聽覺剝奪能夠誘導成年雄性斑胸草雀的鳴曲趨向于更加混亂和不穩定，造成已結晶化的鳴曲結構出現一定程度的退化，表明即使是臨界型鳴禽，成年后穩定的鳴曲也仍需要聽覺反饋來維持，一旦失去聽覺反饋，鳴禽就無法修正和匹配自身鳴曲，進而造成鳴唱行為的退化，導致致聾鳥變成為聾啞鳥，提示聽覺反饋在維持鳴曲的復雜性中發揮重要的功能。

鳴禽鳴唱學習的神經基礎是腦內的鳴唱控制系統，前人研究認為VMP通路在鳴禽學習過程中對鳴曲的穩定性具有重要作用[6，9]。本實驗初步統計與分析致聾14 d后LMAN核團的平均面積和體積有明顯減小的趨勢，LMAN核團內的細胞面密度下降，說明了致聾導致的成年雄性斑胸草雀鳴唱行為的畸變，可能與致聾所導致其腦內發聲學習通路中的輸出核團LAMN核團的退化有一定的的關系，這些結果為了解致聾后聾啞變化可能的機理提供一定的基礎資料，但其具體機制仍有待進一步研究和探討。本實驗樣本量較小，后續實驗需要增加動物樣本量并進一步測定LMAN核團的超微結構變化以獲得LMAN核團形態大小的確切變化。