冠心病血瘀證基因組學研究進展＊

劉蘭椿，何慶勇，陳恒文，傅夢薇，周思遠，王 階＊＊

（1. 中國中醫科學院廣安門醫院 北京 100053；2. 北京中醫藥大學研究生院 北京 100029）

冠心病血瘀證的現代研究認為，血瘀證是血液及其循環系統形態與功能異常的綜合體現，主要與微循環異常、炎癥反應和血管內皮損傷等有關。采用蛋白質組學和代謝組學技術可探索冠心病血瘀證狀態下蛋白質的特異時空表達，而蛋白質的本質是基因的相互作用，信使RNA（messenger RNA，mRNA）則是連接基因和蛋白質的樞紐。基因組學（Genomics）是闡明整個基因組的結構、功能以及相互作用的科學，包括以全基因組測序為目標的結構基因組學、以基因功能鑒定為目標的功能基因組學、比較已知基因組結構的比較基因組學。運用基因組學技術可篩選在冠心病血瘀證中扮演重要角色的基因，作為區分冠心病血瘀證患者和健康者的生物標志物，其介導的生物過程能在一定程度上調控血瘀證的發生發展?；蚪M學技術也為冠心病血瘀證中藥復方的多靶點調控提供了依據，通過藥物靶基因的變化趨勢可驗證冠心病血瘀證治療的效果，更為新藥研發提供了理論基礎。然而通過對既往單個文獻的整理發現，冠心病血瘀證基因組學研究的樣本量較少，多項研究指標尚缺乏系統性，故這項系統評價的目的是：梳理冠心病血瘀證基因組學的研究進展；總結歸納冠心病血瘀證基因組學研究的思路方法。

1 資料與方法

1.1 文獻納入與排除

1.1.1 納入標準

該研究的納入標準如下：①受試者同時符合冠心病和血瘀證診斷標準；②主要結局指標涵蓋基因多態性位點、差異基因表達水平、基因甲基化修飾情況。

1.1.2 排除標準

該研究的排除標準如下：①綜述或述評；②動物實驗；③重復文獻；④血瘀證合并其他證候或未采取基因組學技術。

1.2 文獻檢索

2003年人類基因組計劃的完成標志著醫學遺傳學和基因組學進入后基因時代。計算機檢索Medline、Cochrane Central Register of Controlled Trials、中國知網、萬方數據庫從2003年1月-2020年1月之間的文獻。在搜索策略中，本研究選擇以下術語做為主題詞（包括標題、摘要、關鍵詞）：“冠心病”“血瘀證”“基因”“胸痹”“活血化瘀”“Coronary Artery Disease”“Coronary Heart Disease”“Blood Stasis”“Promote Blood Circulation”“Genomics”等（附錄）。

1.3 信息篩選與提取

2 名研究人員（劉蘭椿和傅夢薇）獨立搜索數據庫篩選所有檢索記錄的標題和摘要，以排除不相關的研究，通過閱讀全文評估剩余的研究，任何分歧都是通過協商一致或通過仲裁者（周思遠）來解決的。隨后研究人員對納入的文獻進行信息提取，內容包括文獻的作者、發表年份、介導的生物過程、差異基因片段、差異基因表達的方向、分組資料、基因組學檢測技術分類等。

2 冠心病血瘀證基因組學研究類型

初步檢索出335 篇相關文獻，其中包括中國知網的187 篇、萬網數據庫的106 篇、Medline 數據庫的12篇、Cochrane Central Register of Controlled Trials 數據庫的30篇，利用文獻管理軟件Noteexpress 剔除了重復的96 篇研究，去重后剩余文獻239 篇。對剩余文獻閱讀文題和摘要初篩刪除133 篇內容不符、主題無關的文獻，剩余106 篇文獻進行閱讀全文復篩。全文復篩后排除了72 篇文獻，其中7 篇綜述或述評、8 篇動物實驗、32 篇臨床資料重復、25 篇為血瘀證合并其他證候或未采取基因組學技術。清理數據后，最終納入定性分析的文獻數為34篇（表1）。按照研究的類型大致可分為基因多態性、差異基因的表達、基因的甲基化修飾3個方面。

表1 納入研究一般情況特征表

續表1

2.1 基因多態性

納入的文獻中共有22 篇由單個核苷酸位置上存在轉換等變異引起的基因多態性研究[1,4-10,12-16,18,20-21,26,28-32]。主要研究技術有聚合酶鏈式反應（PCR）、聚合酶鏈-限制性片段長度多態性（Polymerase chain restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、飛行時間質譜技術（Time-of-flight mass spectrometry，TOF-MS）、等位基因特異性探針（如Taqman探針）以及高通量、靈敏度好、特異性高的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（Matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）等方法，加之運用相對風險分析（Haplotype relative risk，HHRR）和傳遞不平衡（Transmission disequilibrium test，TDT）追溯父母組與病例組的遺傳關系。研究涵蓋血管緊張素轉化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）基因DD 型、內皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因G894T 變異、細胞色素P2C19（CytochromeP 2C19，CYP2C19*2）基因多態性、血管性血友病因子（Von willebrand factor，vWF）基因M-M-型、凝血因子Ⅶ（Coagulation factor Ⅶ，FⅦ）基因M1/M1 型、血漿纖維蛋白原Bβ（FibrinogenBβ，FgBβ）基因C/T 多態性、載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）基因E3/E4 多態性、ATP 結合盒轉運體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）基 因R219K 多 態 性、白 細 胞 介 素-8（Interleukin-8，IL-8）基因A/T 多態性、亞甲基四氫葉酸 還 原 酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因C677T 多態性、基質金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinase-3，MMP-3）基因5A/5A 多態性等，以上基因的多態性均與冠心病血瘀證具有相關性。

2.2 差異基因的表達

共有8 篇分析差異基因表達信息的研究[2-3,11,17,22-25]，主要采用mRNA 差異顯示，cDNA 微陣列，實時熒光定量RT-PCR 對待測樣品進行定量分析，或用Affymetrix 基因芯片進行雜交測序等技術研究細胞編碼基因的調控規律，以闡明生物體在特定生理或病理狀態下表達的所有種類的mRNA 及其功能。已有多個研究發現冠心病血瘀證患者的基因表達程度與健康對照組存在一定程度的差異，從得到的差異基因表達的功能可以看出，它們從不同途徑導致和參與了冠心病血瘀證內皮損傷、細胞凋亡、血小板聚集、血液高凝態、脂代謝、膽固醇轉運、炎癥反應、免疫反應、血管平滑肌增殖過程。

2.3 基因的甲基化修飾

結合血瘀證病理機制以及參考基因啟動子CpG島的注釋情況，選擇性檢測甲基化水平是目前血證DNA 甲基化的主要研究方法，DNA 的甲基化修飾屬于表觀基因組學范疇，指通過DNA 甲基轉移酶（DNA methylation transferase，DNMT）的作用，在5′-CpG-3′的第5個碳原子上合成甲基。目前多采用重亞硫酸鹽測序方法（Bisufite sequence PCR，BSP）、甲基化特異性PCR（MS-PCR）技術或Infinium Human Methylation450 BeadArray 高通量芯片等技術進行檢測，最終根據CpGs 的甲基化或非甲基化DNA 狀態，確立發生甲基化DNA 的分子以及與基因轉錄的作用。對于冠心病血瘀證這一冠心病中最重要的證型，甲基化起到了重要的作用[19,25,27,33-34]，包括影響血管平滑肌增殖的Kruppel 樣 因 子5（Kruppel-like factor 5，KLF5）、LRP12、ER-α和AGTRAP 基因甲基化水平，影響脂代謝水平的DES、CTNNB1、ZEB2 基因甲基化水平，影響血小板聚集的Gp6 基因甲基化，影響炎癥反應的IL-6基因-1118 bp至-826 bp的CpG位點甲基化等。

3 涉及的生物學功能

3.1 血管內皮損傷

多項圍繞血管內皮損傷的研究均與ACE 基因多態性有關[1,4-7,10,12]，ACE 基因DD 型為早發冠心病（男性≤55，女性≤65）血瘀證發病的易感基因[7]，與遺傳因素無關[5]，可能通過調控人體血管內皮功能而影響冠心?。–oronary heart disease，CHD）臨床表現的形成，導致血管緊張素Ⅱ（AgⅡ）、內皮素/一氧化氮（ET/NO）水平上升[1,4]，且其表達顯著高于非冠心病血瘀證的患者，這提示了此基因型可能為冠心病血瘀證的特異基因，而并非只與血瘀證證候有關[4]。DD 型患者存在多支冠脈病變的概率較大，病情較為嚴重[6]，植入支架數更多[12]，除此之外，ACE 的外顯子17 基因片段rs4343（G2350A）多態性也可能是早發冠心病的危險因素之一[10]。eNOS 于血管內產生一氧化氮及協助調節血管功能，有研究運用TOF-MS技術發現eNOS基因G894T型是早發冠心病發病的危險因素之一[8]，這與李建軍[6]運用PCR 得出的結論相矛盾，可能與基因組技術的不同有關。香丹注射液能調節eNOS 和內皮素ET-1的mRNA表達，從而改善冠心病血瘀證患者血管內皮功能[2]。復方丹參滴丸可通過使細胞凋亡相關基因BCLF1 mRNA、Bax mRNA 表達顯著減弱，抑制血管內皮反應引起的損傷，對冠心病血瘀證發揮治療保護作用[11]。另有研究表明，作用于血管內皮、引起內皮損傷 的SLAMF1、CABARA1、ZNF350 基 因[3]及FGF2 基因[24]在冠心病血瘀證組顯著表達。雖然研究表明MEF2A 基因是冠心病的致病基因[35]，研究發現其多態性并不是冠心病血瘀證型的易感基因位點，但受限于納入研究的數量，尚不能得出肯定結論[9]。

3.2 血液流變學改變

冠心病血瘀證血液流變學的改變在基因層面均有體現[13-21]，研究發現冠心病血瘀證與凝血因子Ⅶ（FⅦc）M1/M1 基因型具有相關性[13]，M1/M2 多態性也與冠心病血瘀證存在關聯，但與疾病基因座不存在連鎖，不是遺傳易患基因[16]。Taqman 探針檢測發現血小板膜糖蛋白GPⅡb-Ⅲa 多態性不是冠心病血瘀證的敏感指標，但冠心病血瘀證組的GPⅡb-Ⅲa 活性水平存在顯著性差異，所以并不排除編碼血小板膜糖蛋白的基因中存在其他可能影響其活性表達的多態位點[14]。在臨床療效方面，給予含有至少一個GPⅡb 突變型基因C 的冠心病血瘀證患者血府逐瘀口服液后，發現比AA 型患者在紅細胞變形指數、血瘀證計分有明顯差異，血液流變學方面療效更好，但由于納入患者例數較少，結論仍需檢驗[15]。從預后而言，PCI 術后重度血瘀證患者更易出現CYP2C19*2 基因（GA+AA）突變[18]，隨后更有研究統計發現GA基因型其支架內血栓形成、心肌梗死等不良反應的出現較AA型多[21]。另有研究表明血管性血友病因子vWF 基因M-M-基因多態性可促進血小板黏附形成血栓，纖維蛋白原Bβ鏈FgBβ基因啟動區多態性可升高Fg 而使血液處于血栓前高凝狀態，影響血管壁的切流速度，加速冠心病血瘀證的血栓形成[20]。GP6 基因在焦磷酸測序的實驗中顯示其甲基化水平顯著升高，尤其在早發冠心病血瘀證患者的外周血液當中，提示其甲基化狀態可能和早發冠心病血瘀證的發生具有相關性[19]。有研究者根據瓜蔞薤白半夏湯治療前后血液黏度的結果，設計制備了“病證結合”“以藥測證”芯片，在兩張芯片中篩選出了共同差異表達的血液流變學的4個相關基因[17]。

3.3 炎癥反應與免疫調節

白細胞介素是一種重要的炎性細胞趨化因子，其多態性在冠心病中發揮重要角色[36]，IL-8 基因-251 區的AT 基因型被認為可增加家族聚集性冠心病血瘀證的易感性[26]。白細胞介素基因的甲基化程度也影響著冠心病血瘀證的形成，已有研究表明血瘀證患者IL-6轉錄起始位點前-1118 bp 至-826 bp 序列中7 個位點CpG 位點甲基化程度高于非血瘀證組，但差異尚不明顯[27]。另有多個研究均表明IL-8 或IL-6 基因的差異表達水平均在冠心病血瘀證組上調，進而介導炎癥反應[22,24-25]。除炎癥反應外，免疫調節在冠心病血瘀證患者中差異表達，有研究通過基因芯片分析冠心病血瘀證患者的外周血白細胞，得到48 個差異基因，富集了10條通路，其中有5個涉及炎癥和免疫反應，說明了免疫反應介導血瘀證的發生發展的比例和顯著性優勢[22]。另有研究發現，免疫相關蛋白激酶Cβ1（PKCβ1）、免疫球蛋白IgG 結晶片段受體ⅢA（FcγRⅢA）的mRNA 表達在冠心病血瘀證患者中也均有顯著差異[23]。

3.4 血管平滑肌增殖

有研究運用焦硫酸測序技術檢測發現α雌激素受體（Estrogen Receptor-α，ER-α）、AGTRAP 基因啟動子區域的甲基化狀態與冠心病血瘀證血管平滑肌增殖密切相關[19]，可能通過調節血管平滑?。╒ascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖影響動脈粥樣硬化的發展，同理運用MS-PCR 發現冠心病血瘀證患者的KLF5、低密度脂蛋白相關蛋白12（Low density lipoproteinrelated protein12，LRP12）基因啟動子的甲基化水平較健康人低[25]。MMP-3-1171 區的5A/6A 基因型及5A 等位基因可使血管平滑肌細胞凋亡進而影響動脈粥樣硬化斑塊的形成和穩定，從一定角度揭示了增加血瘀證發生風險的原因[29]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）作為血同型半胱氨酸Hcy 代謝途徑中的一種關鍵酶[37]，其活性降低可引起Hcy 水平升高，刺激血管平滑肌細胞增生，最終導致動脈粥樣硬化，增加冠心病的發生風險。研究發現MTHFR 基因C677T 多態性與胸痹心血瘀阻證和血Hcy 水平均有相關性，可導致MTHFR 活性降低，且CC 基因型更傾向于在心血瘀阻證中表達[30]。G 蛋白β3 亞單位基因（GNB3）介導許多刺激血管增生效應，細胞外血管活性多肽、生長因子均通過激活血管平滑肌細胞膜上的G 蛋白，控制血管平滑肌細胞的舒縮、合成、分泌、分化、遷移和增生等功能。研究表明，GNB3基因825T等位基因攜帶不僅是誘發冠心病血瘀證的因素之一，而且可能提示預后不良，體現為加減血府逐瘀湯對GNB3基因825T等位基因攜帶人群療效較差[28]。

3.5 血脂水平

許多基因可通過影響血脂水平進而與冠心病相關。載脂蛋白E（ApoE）有E2、E3、E4 三種主要的異構體，分別受ε2、ε3、ε4 三個等位基因編碼，研究發現ApoE 的E3/E4 基因型和ε4 等位基因與冠心病血瘀證有相關性，且可影響血脂水平[31]。ATP 結合盒轉運子ABCA1 在膽固醇從周圍細胞流出和HDL 生成的起始步驟中起著重要的作用，被認為是HDL-C代謝的限速因子，李杰等利用MALDI-TOF-MS 技術發現ABCA1基因219位點的R219K多態性在早發冠心病和健康人群差異有顯著性[32]。補體系統C3、基質金屬蛋白MMP-9 基因的表達也可通過影響血脂與家系冠心病血瘀證斑塊形成相關[24]。另有研究運用高通量芯片技術檢測發現DES、CTNNB1、ZEB2 基因的甲基化修飾可能是冠心病血瘀證的易感危險因素，且具有上述基因甲基化的患者血脂水平較高，加減養心通脈方對冠心病血瘀證DES、CTNNB1、ZEB2 三個易感基因甲基化的修飾及對血脂水平均有調控作用[33-34]。

4 討論

4.1 冠心病血瘀證基因組學的研究思路

根據納入文獻的一般情況特征，可總結冠心病血瘀證基因組學的研究思路包括：臨床選擇一定數量的冠心病血瘀證患者作為試驗組并設置合理的對照組，隨后根據基因多態性、差異基因表達、基因甲基化修飾3 個基因組學研究類型的不同，運用PCR 技術、TOF-MS技術、Taqman探針、Affymetrix 基因芯片、重亞硫酸鹽純化等基因組學檢測方法，進行冠心病血瘀證相關基因的篩查和驗證，尋找差異基因片段并進行生物信息學分析，研究基因組結構及基因之間相互作用，探討其與冠心病血瘀證病理改變的相關性（圖1）。在上述研究思路的基礎上運用活血化瘀中藥進行干預治療，可明晰方藥對冠心病血瘀證發揮治療保護作用的基因組學機制，辨析方藥對何種基因型的冠心病血瘀證患者療效較好。

4.2 冠心病血瘀證生物學功能及調控基因總結

冠心病血瘀證是血液及其循環系統形態與功能異常的綜合體現，主要與血管內皮損傷、微循環異常和炎癥反應等有關。其中血管內皮損傷主要與ACE、eNOS 以及ET-1、BCLF1、Bax、SLAMF1 凋亡類基因的表達有關；血液流變學改變與FⅦc、FgBβ凝血類基因的表達，GPⅡb-Ⅲa、CYP2C19*2、vWF 血小板相關基因的表達，GP6 基因的甲基化狀態有關；IL-8 基因多態性、IL-6 甲基化程度在冠心病血瘀證患者的炎癥反應中也均有顯著差異，PKCβ1、FcγRⅢA的mRNA 表達均介導了冠心病血瘀證的免疫反應；ER-α、AGTRAP、KLF5、LRP12 甲基化狀態，MMP-3、MTHFR、GNB3 基因多態性均可調節血管平滑肌（VSMC）的增殖影響冠心病血瘀證動脈粥樣硬化的發展；ApoE、ABCA1 多態性，補體C3、MMP-9 基因的表達，DES、CTNNB1、ZEB2基因的甲基化修飾均對冠心病血瘀證患者的血脂水平有特異性調控作用。

4.3 不足與展望

圖1 冠心病血瘀證基因組學的研究思路

冠心病血瘀證在基因多態性、差異基因表達、基因甲基化修飾方面均有較多研究，本系統綜述歸納了冠心病血瘀證研究所涉及的基因組學技術、生物學過程及相應的代表基因。追溯原始文獻發現，使用基因芯片測序的樣本量普遍較少，其準確性仍需檢驗，雖然研究中納入患者的基礎條件不完全相同，但基線大致相平，具有可比性。展望未來，考慮到冠心病血瘀證的病理學表現并不是單個基因錯誤表達的結果，而是由多基因調控網絡紊亂導致的生物學功能改變，一個基因的上調或下調會影響上下游基因的表達狀態，因此要求我們對已有文獻支撐的多個基因進行綜合性的、網絡性的“聯合基因型分析”工作?？蓪ξ墨I中的相關基因運用CYTOSCAPE 進行網絡構建，MCODE進行模塊劃分后再對重要模塊進行功能與通路分析[38]。例如兩個基因是各自模塊的重要組成基因，同時又聯系于其他模塊，并與外部模塊的通路、基因或功能相關聯，該研究方法既體現了冠心病血瘀證基因的整體特點，又關注了基因網絡的局部差異，探索冠心病血瘀證不同亞型的特異基因或成為未來冠心病血瘀證基因組學深入研究的方向，可為冠心病“病證結合”的預防與治療提供新的思路。

附錄

知網：SU =（‘冠心病’+‘胸痹’）*（‘血瘀證’+‘活血化瘀’）*（‘基因’+‘多態性’）187

萬方：題名或關鍵詞:(冠心病+胸痹)*題名或關鍵詞:（血瘀證+活血化瘀）*題名或關鍵詞:（基因+多態性）106

Medline: 12

Cochrane Central Register of Controlled Trials: 30

續表