吡格列酮保護糖尿病大鼠腎缺血再灌注損傷的實驗研究

鄒叢 胡紅林 涂云明 陳同長 王煒超

1南昌大學第四附屬醫院內分泌科（南昌330003）；2南昌大學第二附屬醫院泌尿外科（南昌330006）

腎臟疾病可以因多種因素引起，如缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）、糖尿病[1]。然而，腎IRI是急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的主要病因之一，也是糖尿病的常見并發癥[2]。糖尿病是腎功能正?；颊呤中g后AKI的獨立預測因素，而且，臨床研究顯示高血糖與AKI 高發生率明顯相關[3]。術中高血糖可以導致過量產生細胞凋亡和氧化應激，尤其可以在腎臟中產生，進而引起腎損傷[4]。因此，需要進一步的實驗研究來預防或保護這種腎疾病的發生。腎IRI的各種治療方法中減輕腎細胞凋亡被認為是保護腎損傷的重要環節[5-6]。筆者以前的研究表明，治療2型糖尿病的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）激活劑吡格列酮可以通過抗凋亡和抗氧化應激保護非糖尿病小鼠腎IRI[7-8]。TAWFIK[9]報道吡格列酮可以通過調節氧化應激和炎癥而減輕糖尿病大鼠急性IRI 誘導的腎損傷。本研究旨在探討吡格列酮通過抗凋亡作用保護糖尿病大鼠腎IRI。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SD 大鼠（6～8 周齡，200～250 g，SPF級）購自南昌大學醫學院動物實驗科學部。本實驗所有操作均遵循南昌大學動物實驗倫理委員會操作流程。

1.2 實驗試劑吡格列酮購自江蘇恒瑞制藥公司，STZ 購自美國Sigma 公司，兔抗鼠bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8和β-actin 抗體購自美國Abcam公司，TUNEL 檢測試劑盒購自武漢博士德生物科技公司。

1.3 2型糖尿病大鼠建立2型糖尿病大鼠模型通過腹腔注射單劑量STZ（50 mg/kg）建立，注射STZ 一周后，大鼠禁食8 h，從尾靜脈采血檢測血糖，空腹血糖＞250 mg/dL 考慮建模成功[10]，則進行下一步實驗。

1.4 實驗設計采用隨機對照設計原則，將大鼠隨機分成如下6組：（1）IRI組（n= 8）：正常SD 大鼠行腎IRI 手術；（2）DM+IRI組（n= 8）：糖尿病大鼠行腎IRI；（3）吡格列酮+IRI（n= 8）：正常SD 大鼠術前一周接受鼻飼吡格列酮（每日10 mg/kg），然后再經歷腎IRI；（4）吡格列酮+DM+IRI（n= 8）：糖尿病SD 大鼠術前一周接受鼻飼吡格列酮（每日10 mg/kg），然后再經歷腎IRI；（5）假手術組（n=8）：正常SD 大鼠假手術；（6）DM+假手術組（n=8）：糖尿病大鼠假手術。

1.5 大鼠腎IRI模型建立 大鼠手術前禁食8～12 h，采用2%水合氯醛（2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，具體手術過程如下：腹部正中行1.5～2 cm 切口，逐層分離進入腹腔，將腸道推向一側，暴露腎蒂，用無損傷血管夾夾閉雙側腎蒂45 min，然后移除血管夾恢復腎臟血流，關閉切口。術中應用生理鹽水使動物保持充分水化，術后動物給與充足飼料和水。假手術組動物雙側腎蒂不夾閉，其余操作相同。

1.6 腎功能檢測術后24 h 從大鼠內眥靜脈叢取血標本0.5 mL，并4 500 r/min 離心10 min，提取血清檢測肌酐和尿素氮水平。

1.7 腎臟組織病理學評估各組大鼠術后24 h 處死并取出腎臟，腎臟沿長軸切開，固定于10%福爾馬林溶液中，石蠟包埋。切成4 μm組織玻片，行常規蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學顯微鏡下觀察腎小管壞死情況。每張玻片隨機選取皮髓交界處20個視野，按RABB 等[11]方法進行半定量評分，評估腎小管壞死程度，評分越高代表損傷越嚴重。

1.8 TUNEL檢測 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的末端標記法（TUNEL 法）檢測DNA 鏈破裂情況。將制作后的玻片在二甲苯中去除石蠟，經梯度乙醇溶液再水化后，按TUNEL 試劑盒說明書操作染色，隨機選取皮髓交界處20個視野（200×），定量觀察TUNEL 陽性細胞數。

1.9 WesternBlot檢測 各組大鼠術后24 h 處理并取出腎臟，腎臟在冰塊上制作成細胞勻漿并離心。采用考馬斯亮蘭法（Bradford 法）檢測蛋白濃度。應用常規Western Blot 法檢測各組大鼠腎組織中caspase-3、caspase-8、bcl-2和bax 蛋白的表達，并將最終條帶進行定量分析。內參照為β-actin。1.10 統計學方法 所有資料應用GraphPad Prism 5.0 進行統計分析，數據以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 吡格列酮降低血清肌酐和尿素氮與假手術組相比，腎IRI組大鼠血清肌酐和尿素氮明顯升高（P＜0.01），然而，應用吡格列酮明顯抑制了其升高，與IRI組和DM+IRI組相比，吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組血清肌酐和尿素氮均明顯降低（P＜0.05）。然而，吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組之間血清肌酐和尿素氮差異無統計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 吡格列酮保護腎IRI 后腎功能Fig.1 Pioglitazone protected renal function after renal IRI

2.2 吡格列酮降低腎細胞凋亡與假手術組相比，IRI組和DM+IRI組腎細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），而IRI組和DM+IRI組之間腎細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。與IRI組和DM+IRI組相比，吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組腎細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。結果表明：吡格列酮在正常大鼠和糖尿病大鼠均能抑制腎細胞的凋亡（圖2）。

圖2 吡格列酮降低腎IRI后腎細胞凋亡Fig.2 Pioglitazone reduced renal cell apoptosis after renal IRI

2.3 吡格列酮降低腎小管損傷假手術組腎臟顯示正常的腎組織學形態（圖3），而IRI組和DM+IRI組腎臟顯示不同程度的缺血性腎損傷，包括廣泛的腎小管結構變性、膨脹、水腫、空泡形成以及壞死（圖3A）。與假手術組相比，IRI組和DM+IRI組腎小管損傷病理評分明顯升高（P＜0.01），而IRI組和DM+IRI組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。與IRI組和DM+IRI組相比，吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組腎小管損傷病理評分明顯降低（P＜0.05，圖3B）。

2.4 吡格列酮升高腎組織中bcl-2蛋白表達和降低bax 蛋白的表達與假手術組相比，IRI組和DM+IRI組腎組織中bcl-2 蛋白表達明顯降低，bax蛋白表達明顯升高（P＜0.01）。然而吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組腎組織中bcl-2 蛋白表達明顯升高（P＜0.01），bax 蛋白表達明顯降低（P＜0.01，圖4）。

2.5 吡格列酮降低腎組織中caspase-3和caspase-8蛋白剪切片段的表達Caspase-3和caspase-8是caspase 依賴性細胞凋亡的關鍵蛋白酶。為了探討吡格列酮在腎IRI 中的作用，本研究檢測了腎IRI后腎組織中caspase-3和caspase-8 蛋白的表達情況，結果顯示：所有組腎臟中，pro-caspase-3和procaspase-8蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。然而，與假手術組相比，IRI組和DM+IRI組腎組織中caspase-3 蛋白剪切片段P17和caspase-8 蛋白剪切片段P18 表達明顯升高（P＜0.01），但是應用吡格列酮治療可以明顯抑制其升高（P＜0.01，圖5）。

3 討論

筆者以前的研究表明，治療2型糖尿病的PPAR-γ激活劑吡格列酮可以通過抑制腎細胞凋亡和改善抗氧化活性而保護正常小鼠的腎IRI[7-8]。在本研究中，進一步闡明吡格列酮通過抑制細胞凋亡減輕糖尿病大鼠腎IRI，發現吡格列酮可以改善糖尿病大鼠腎IRI 后腎組織病理學和生化等指標。

腎IRI是臨床腎移植、腎部分切除術和其他腎臟外科手術時常見的病理過程，也是糖尿病常見的并發癥。大量的文獻研究了腎IRI的相關機制，包括細胞凋亡、氧自由基損傷、內皮損傷、鈣超載和細胞能量代謝紊亂等，其中，細胞凋亡被認為是主要的因素之一[12-13]。

圖3 腎IRI 后24 h 各組大鼠腎臟組織形態學評估Fig.3 Renal histomorphology was evaluated in rats 24 hours after renal IRI

圖4 腎IRI 后24 h 各組大鼠腎組織bcl-2和bax 蛋白的表達Fig.4 Expression of bcl-2 and bax proteins in renal tissue of rats 24 hours after renal IRI

吡格列酮通過抗炎和抗纖維化效應在腎小球腎炎、腎小球硬化癥和糖尿病腎病中發揮治療作用[14-15]，吡格列酮可以在很低的水平激活PPAR-γ，導致PPAR-γ 與相應受體結合，同時招募協同因子，最后調控協同因子的轉錄。研究[16]表明，吡格列酮通過抑制胰島素抵抗或氧化應激改善糖尿病腎病。也有研究顯示吡格列酮通過抑制細胞凋亡和抗炎抗氧化作用保護IRI[17-19]。本研究通過雙側腎動脈阻斷45 min 建立腎IRI 糖尿病大鼠模型，吡格列酮治療組動物的血清肌酐和尿素氮明顯降低，表明吡格列酮可以改善糖尿病大鼠腎IRI 后的腎功能。

圖5 腎IRI 后24 h 各組大鼠腎組織caspase-3和caspase-8 蛋白的表達Fig.5 Expression of caspase-3 and caspase-8 proteins in renal tissue of rats 24 hours after renal IRI

本研究中，探討腎IRI 過程中腎細胞的凋亡，發現吡格列酮抑制糖尿病大鼠腎IRI 腎小管細胞凋亡與筆者以前在正常小鼠中研究結果一致[7]。后又應用TUNEL 技術檢測了吡格列酮在糖尿病大鼠腎IRI 后腎細胞凋亡的影響，表明吡格列酮可以明顯降低腎細胞凋亡率。而且，吡格列酮的細胞保護作用也涉及bcl-2和caspase 家族基因的表達，吡格列酮誘導bcl-2的表達，并與bax 蛋白相互作用而拮抗它們的死亡促進活性，吡格列酮在糖尿病大鼠腎組織中抑制caspase-3和caspase-8 剪切片段表達。

2型糖尿病可以導致器官功能障礙和增加器官對損傷的敏感性[20]。研究發現糖尿病合并腎缺血比單獨糖尿病更容易加重腎功能障礙，更加明顯的腎小球損害[20-21]。這些結果強調了MELIN 等[22]提出的猜測即糖尿病聯合腎缺血在糖尿病腎病的形成中起了重要的作用。在本研究首次證實吡格列酮可以通過抑制腎細胞的凋亡而保護糖尿病大鼠腎缺血損傷，為今后糖尿病腎IRI的防治提供了理論依據和治療靶標。

吡格列酮作為PPAR-γ激動劑，可以調控著與脂質代謝、葡萄糖穩態和炎癥相關的多種基因[23]，因此，吡格列酮對糖尿病腎IRI的保護作用的具體機制，不僅僅局限于抑制腎細胞的凋亡，其過程可能涉及一些其他的復雜機制，在今后的研究中，將進一步的探索與證實。而且，本文只進行了體內動物實驗的研究，有待于在體外實驗中進一步的研究。