絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用及其機制

劉東慧，付文亮，付秀美，宋成軍，陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000)

2型糖尿病以胰島素抵抗為主要特征，而胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要原因之一[1-2]。胰島素與胰島素受體(insulin receptor，IR)結(jié)合后主要通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取、糖原合成和降解，從而發(fā)揮降低血糖的作用[3-5]。目前臨床用于糖尿病治療的西藥雖有較好的降糖效果，但不良反應(yīng)較多，且不能有效改善胰島素抵抗。因此，在天然藥物中尋找一種安全有效的降糖藥物十分必要。絲膠(蠶繭水提取物)是一種天然水溶性蛋白，民間有蠶繭泡水降血糖的驗方，本課題組[4,6-8]前期進行糖尿病的中醫(yī)藥防治研究時也發(fā)現(xiàn)：絲膠能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖，并對肝臟、腎臟和胰腺等臟器具有保護作用，但具體降血糖機制尚不清楚。目前國內(nèi)外對于絲膠的研究[9-10]主要集中在紡織、化妝品和生物材料等方面，在糖尿病治療方面尚無相關(guān)研究報道。肝臟是胰島素作用的重要靶器官之一，同時在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面具有重要作用。因此，為深入了解絲膠降血糖的機制，本研究通過觀察大鼠肝組織中IR、胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)、PI3K和Akt蛋白表達的變化來探討絲膠是否通過影響肝臟胰島素PI3K/Akt信號通路發(fā)揮降血糖的作用，以期為糖尿病的中醫(yī)藥防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器36只雄性SPF級SD大鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國Sigma公司)，臨用前用檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.4)配制成2%的溶液；絲膠，將彩色蠶繭(承德醫(yī)學(xué)院桑蠶所提供)經(jīng)浸泡、煮沸、濃縮、透析等步驟后凍干至粉末所得，灌胃前用生理鹽水溶解至相應(yīng)濃度[11]；濃縮型DAB顯色試劑盒和生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗PI3K多克隆抗體(美國BD公司)；兔抗IR單克隆抗體、Akt單克隆抗體和兔抗IRS-1多克隆抗體(美國Abcam公司)；BCA法蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；糖原染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。Leica RM2235切片機(德國Leica公司)，BH-2型Olympus顯微鏡和攝像裝置(日本Olympus公司)，DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 糖尿病動物模型的建立將SD大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，連續(xù)2 d腹腔注射STZ，劑量為35 mg·kg-1·d-1，以STZ注射結(jié)束后72 h的空腹血糖≥11.1 mmol·L-1作為2型糖尿病大鼠模型的成模標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.3 實驗動物分組和處理將36只大鼠隨機分為正常組、模型組和實驗組，每組12只。實驗組和模型組大鼠在造模成功后分別給予2.4 g·kg-1·d-1的絲膠和等體積生理鹽水連續(xù)灌胃35 d，正常組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃相同時間。用藥結(jié)束，所有大鼠禁食12 h后麻醉、采集血液標(biāo)本、斷頭處死、取肝組織進行相關(guān)檢測。

1.4 各組大鼠血糖水平檢測將所取血液標(biāo)本3 000 r·min-1離心20 min后分離血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測各組大鼠血糖水平。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白表達肝組織固定、包埋后以厚度5 μm連續(xù)切片。將切片脫蠟、37℃、3% H2O2-甲醇孵育30 min、微波抗原修復(fù)后，加入一抗(濃度：IR 1∶100、IRS-1 1∶100、PI3K 1∶100和Akt 1∶200)4℃過夜(用PBS代替一抗作為陰性對照)，二抗37℃孵育30 min，DAB染色，蘇木精復(fù)染肝細胞核，陽性表現(xiàn)為細胞膜和(或)細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色和(或)棕褐色顆粒。定量分析：每只大鼠隨機選取10張非連續(xù)切片，每張切片隨機選取5個200倍視野，采用Image-ProPlus 6.0軟件測定每個視野中陽性表達產(chǎn)物的積分光密度(integrated optical density,IOD)值，以IOD值作為目的蛋白表達水平。

1.6 Western blotting法檢測各組大鼠肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白表達水平取100 mg液氮中保存的肝組織，提取總蛋白并測定濃度。取100 μg總蛋白上樣，10%(IR、IRS-1和PI3K)或12%(Akt和β-actin)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后一抗(β-actin 1∶1 000，IR 1∶1 000，IRS-1 1∶1 000，PI3K 1∶500，Akt 1∶1 000)、二抗(1∶5 000)室溫搖床分別孵育2.0和1.5 h，顯影、掃描膠片后應(yīng)用Quantity One-v4.6.2軟件分析目的蛋白和β-actin條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.7 過碘酸-Schiff染色法檢測各組大鼠肝糖原含量肝組織固定、包埋后以厚度5 μm連續(xù)切片。用淀粉酶處理過的肝切片作為陰性對照。切片脫蠟，高碘酸溶液氧化，雪夫試劑避光染色，蘇木精復(fù)染細胞核，陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)中出現(xiàn)紅色或紫紅色顆粒。定量分析同免疫組織化學(xué)方法。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖水平正常組、模型組和實驗組大鼠血糖水平分別為(10.83±2.03)、 (29.45±4.82) 和(13.20±4.09) mmol·L-1。模型組大鼠血糖水平明顯高于正常組(P<0.05)，實驗組大鼠血糖水平明顯低于模型組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白表達水平免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示：各組大鼠肝組織中均可見IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白的表達，表現(xiàn)為棕黃色和(或)棕褐色顆粒，其中IR、IRS-1和Akt蛋白主要表達于肝細胞胞膜和胞質(zhì)，PI3K蛋白主要表達于肝細胞胞質(zhì)(圖1，見插頁二)。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示：在蛋白相對分子質(zhì)量95 000、131 000、110 000、56 000和43 000處可見清晰的IR、IRS-1、PI3K、Akt和β-actin條帶。見圖2。

免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法定量分析結(jié)果顯示：模型組大鼠肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白表達水平明顯低于正常組 (P<0.05)；實驗組大鼠肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白表達水平明顯高于模型組 (P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠肝組織中肝糖原含量各組大鼠肝組織切片均可見胞質(zhì)中出現(xiàn)紅色或紫紅色顆粒。其中模型組大鼠肝組織中肝糖原含量(105.11±13.20)明顯低于正常組(465.45±23.40)(P<0.05)，而實驗組大鼠肝組織中肝糖原含量(380.76±12.10)明顯高于模型組(P<0.05)。見圖3(插頁二)。

Lane 1:Normal group; Lane 2:Model group; Lane 3:Experimental group.

圖2 各組大鼠肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of IR, IRS-1, PI3K and Akt proteins in liver tissue of rats in various groups

3 討 論

肝臟是胰島素作用的重要靶器官之一，其在調(diào)節(jié)糖類代謝方面具有重要的作用。胰島素與肝細胞膜上的IR結(jié)合后激活胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)，活化的IRS與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合，進一步活化催化亞基p110從而激活PI3K，PI3K產(chǎn)生的第二信使磷脂酰肌醇3磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate,PIP3)能促進下游Akt的活化[13-14]。Akt活化后可通過促進葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白囊泡向細胞膜轉(zhuǎn)運，進而將胞外的葡萄糖轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)[15-16]，還可促進糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)介導(dǎo) 糖原合成[17-18]，同時還能使轉(zhuǎn)錄因子-過氧化物酶刺激因子受體協(xié)作子α磷酸化而抑制肝細胞糖異生[19]，從而起到調(diào)節(jié)血糖的作用。因此，在肝調(diào)節(jié)糖類代謝的過程中，胰島素PI3K/Akt信號通路具有十分重要的作用。

表1 各組大鼠肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白表達水平

GroupMethodIRIRS-1PI3KAktNormal Immunohistochemical staining615.24±101.26380.29±35.43185.22±22.53435.21±52.01Western blotting1.00±0.091.04±0.040.73±0.030.84±0.10Model Immunohistochemical staining148.12±140.88?157.12±43.50?47.79±15.87?135.44±15.78?Western blotting0.64±0.06?0.80±0.03?0.32±0.01?0.47±0.06?Experimental Immunohistochemical staining332.12±22.04△359.37±58.99△163.01±11.61△381.56±27.12△Western blotting0.89±0.09△0.95±0.03△0.60±0.03△0.79±0.11△

*P<0.05 compared with normal group;△P<0.05 compared with model group.

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠肝組織中IR蛋白表達水平低于正常組，與錢俊文等[20]的胰島素抵抗機制實驗研究結(jié)果一致，即IR在肝臟胰島素PI3K/Akt信號通路中起著十分重要的作用，其表達水平降低或基因突變均可導(dǎo)致肝細胞膜表面IR數(shù)目減少，從而降低胰島素敏感性而引發(fā)胰島素抵抗。同時本研究結(jié)果顯示：PI3K/Akt信號通路中下游關(guān)鍵因子IRS-1、PI3K和Akt的變化趨勢與IR相同。而對實驗組大鼠進行絲膠蛋白灌胃治療后發(fā)現(xiàn)：大鼠肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt蛋白表達水平及肝糖原含量均明顯升高，提示絲膠可通過提高IR表達水平引發(fā)IRS-1酪氨酸磷酸化水平升高，進而刺激下游PI3K和Akt的活化。Akt活化水平升高后，一方面可通過影響囊泡中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的作用加速對葡萄糖的轉(zhuǎn)運；另一方面還可促進GSK3介導(dǎo)的肝糖原合成，使大鼠肝糖原含量明顯升高；同時還可通過促進轉(zhuǎn)錄因子-過氧化物酶刺激因子受體協(xié)作子α磷酸化來增強對糖異生的抑制作用。因此，上述3個方面通過增加葡萄糖的利用效率、減少葡萄糖的來源使得實驗組大鼠血糖水平明顯降低。

綜上所述，在高血糖狀態(tài)下，肝臟胰島素PI3K/Akt信號通路中相關(guān)因子表達水平下降影響了胰島素正常生理作用的發(fā)揮，而絲膠蛋白可通過上調(diào)肝組織中IR、IRS-1、PI3K和Akt等關(guān)鍵因子的表達來增強肝臟胰島素PI3K/Akt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)，進而影響葡萄糖的來源和利用效率而起到降低血糖的效果，這可能是絲膠蛋白降低血糖的作用機制之一。