人參果多糖對人舌鱗癌CAL27細胞增殖的抑制作用及其機制

王會俞，張天夫，郝 苗，張 楚，王曉峰

(1.吉林大學中日聯誼醫院口腔科, 吉林 長春 130033;2. 吉林大學中日聯誼醫院科研中心, 吉林 長春130033)

口腔癌(oral cancer，OC)是世界第6位常見癌癥，其中90%以上為口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)[1-2]。由于口腔頜面部解剖結構復雜，位置特殊，手術治療可能會導致面部變形、咀嚼困難、發音問題和美學問題，降低患者生存質量[3]；手術聯合放化療會產生一些不良反應(嘔吐、脫發和肌肉萎縮等)[4]。因此，開發一種效果明確、不良反應少的新型抗OSCC藥物，對提高患者生存質量和改善患者預后具有重要的科學意義和臨床價值。

中藥多糖是中藥的主要活性成分之一，可通過調節機體免疫功能，發揮其抗腫瘤作用，且具有不良反應少等優點[5-8]。有研究[9-10]顯示：水溶性人參果多糖(water soluble ginseng berry polysaccharide，WGBP)可預防腸道腫瘤，抑制黑色素瘤生長和轉移。但目前對于WGBP的研究僅限于對腫瘤細胞增殖抑制作用的探討，其抑制腫瘤的具體作用機制尚不清楚，特別是關于WGBP對OSCC的抗腫瘤作用和機制報道較少。因此，本研究以人舌鱗狀細胞癌(簡稱舌鱗癌)CAL27細胞為研究對象，明確WGBP抑制CAL27細胞增殖的作用和潛在機制，為開發以WGBP為主要原料的抗OSCC藥物或功能性食品提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人舌鱗癌CAL27細胞株 (美國ATCC細胞庫)。人參果(中國吉林省撫松縣)，單糖標準品(中國上海Sigma-Aldrich公司)，層析柱和C1 6/26 DEAE-Sepharose Fastflow凝膠(美國GE公司)， DMEM培養基(美國Corning公司)，胎牛血清和青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司)，CCK-8檢測試劑盒(日本Dojindo公司)，RIPA細胞裂解液(南京碧云天公司)，TRIzol(美國Invitrogen公司),Western blotting蛋白預染Marker[生工生物技術(上海)有限公司]，細胞凋亡試劑盒(中國天津三箭生物技術有限公司)，PI和RNase (美國Sigma公司)，β肌動蛋白(β-actin)抗體、半胱氨酸蛋白酶-3酶原(pro-Caspase-3)抗體、多聚ADP-核糖聚合酶酶原(poly ADP-ribose polymerase zymogen， pro-PARP)抗體(美國CST公司)。Odyssey紅外成像系統(Licor Odyssey，美國Li-cor公司)，流式細胞儀(FC 500MCL，美國Beckman公司)

1.2 細胞培養人舌鱗癌CAL27細胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基，在37℃、5% CO2的濕化環境中培養。

1.3 WGBP的提取和單糖組成分析將人參果于100℃沸水煮提4 h, 過濾, 沉淀重復提取2次，合并3次提取所得濾液，利用單煎機保持微沸狀態濃縮, 離心, 棄去沉淀。取上清于60℃水浴濃縮, 至室溫后, 加入95%乙醇調節乙醇終濃度為80%, 沉淀過夜。離心,收集沉淀。向沉淀中加入蒸餾水, 充分溶解, 重復醇沉1次。沉淀用蒸餾水復溶后冷凍干燥, 獲得WGBP，再將WGBP凍干粉稱質量后加入超純水溶解，配置成不同質量濃度的水溶液。單糖組成分析:稱取多糖樣品, 依次用鹽酸、甲醇溶液和三氟乙酸溶液水解, 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)衍生化后高效液相色譜法(high pressure liquid chromatography，HPLC)檢測。檢測波長為245 nm。

1.4 CCK-8法檢測各組CAL27細胞增殖率將CAL27細胞以8×103mL-1的密度接種于96孔培養板培養過夜，再以不同濃度(0、1、2和5 g·L-1)WGBP處理24 h，分別作為對照組和1、2及5 g·L-1WGBP組，每孔加10 μL CCK-8溶液,避光，37℃孵育2 h，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度(A)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率= (實驗組A值-空白對照組A值)/(對照組A值-空白對照組A值) ×100%。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期將CAL27細胞以6×105mL-1的密度接種于6孔培養板培養過夜，再以不同濃度(0、1、2和5 g·L-1)WGBP處理24 h，預冷PBS緩沖液清洗2次，無EDTA的胰蛋白酶消化后收集細胞，預冷PBS緩沖液清洗細胞1次，70%乙醇固定, PBS緩沖液清洗2次后重懸加入PI溶液和RNase,避光30 min，流式細胞儀檢測各組細胞周期分布。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率將CAL27細胞以6×105mL-1的密度接種于6孔培養板培養過夜，再以不同濃度(0、1、2和5 g·L-1)WGBP處理24 h，消化并收集細胞， Binding Buffer重懸細胞，按照細胞凋亡試劑盒說明書向每管中依次加入Annexin Ⅴ-FITC/PI結合液，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測各組細胞中pro-Caspase-3和pro-PARP蛋白表達量將CAL27細胞以6×105mL-1的密度接種于6孔培養板培養過夜，再以不同濃度(0、1、2和5g·L-1)WGBP處理24 h，消化并收集細胞，加入RIPA超聲裂解細胞，收集上清并測定蛋白濃度，12% SDS-PAGE以80～100 V恒壓電泳分離蛋白，采用濕轉法以100 V恒壓將蛋白轉至PVDF膜上，加入封閉液孵育1 h，β-actin、pro-Caspase-3和pro-PARP一抗孵育過夜(稀釋比例均為1∶1 000)，二抗室溫避光孵育1 h(稀釋比例為1∶30 000)。TBST清洗3次，以β-actin為內參蛋白， Odyssey紅外成像系統檢測分析蛋白條帶。

2 結 果

2.1 WGBP單糖組成HPLC檢測結果顯示：WGBP多糖由(51.2±3.9)%的半乳糖、(19.1±1.9)%的半乳糖醛酸、(11.3±2.1)%的葡萄糖、(10.5±1.2)%的阿拉伯糖、(5.4±1.2)%的鼠李糖和(2.5±0.7)%的甘露糖組成。

2.2 各組CAL27細胞增殖率與對照組比較，不同濃度WGBP組CAL27細胞增殖率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且呈濃度依賴性。見圖1。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group. 1:Control group; 2-4: 1,2 and 5 g·L-1WGBP groups.

圖1 CCK-8法檢測各組CAL27細胞增殖率

Fig.1 Proliferation rates of CAL27 cells in various groups detected by CCK-8 method

2.3 各組不同細胞周期CAL27細胞百分比與對照組比較，1 g·L-1WGBP組細胞周期分布無明顯變化；2和5 g·L-1WGBP組S期CAL27細胞百分比明顯降低(P<0.05或P<0.01)，G2/M期CAL27細胞百分比明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且呈濃度依賴性。見圖2和表1。

2.4 各組CAL27細胞凋亡率1 g·L-1WGBP組細胞總凋亡率為(19.48±1.28)%，以早期凋亡(16.89%±3.29%)為主。隨著WGBP作用濃度增加，細胞凋亡率也逐漸升高。2 g· L-1WGBP組細胞總凋亡率為(56.10±3.25)%，仍以早期凋亡(53.25%±2.16%)為主。5 g·L-1WGBP組細胞總凋亡率為(88.86±3.49)%，其中早期凋亡率為(83.17±5.32)%，晚期凋亡率為(5.69±3.21)%。與對照組(12.73%±3.84%)比較，各劑量WGBP組CAL27細胞總凋亡率明顯升高(P<0.05)，且呈濃度依賴性。見圖3。

A:Control group; B:1 g·L-1WGBP group; C:2 g·L-1WGBP group; D:5 g·L-1WGBP group.

表1 各組不同細胞周期CAL27細胞百分比

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

A:Control group; B:1 g·L-1WGBP group; C:2 g·L-1WGBP group; D:5 g·L-1WGBP group.

2.5 各組CAL27細胞中pro-PARP和pro-Caspase-3蛋白表達量與對照組比較，不同濃度WGBP組CAL27細胞中pro-Caspase-3蛋白表達量逐漸下降，即pro-Caspase-3發生降解，而pro-PARP表達量也逐漸減少，且二者均具有濃度依賴性。見圖4。

3 討 論

中藥多糖是一類由單糖組成的天然高分子化合物，近年來研究者對中藥多糖的抗腫瘤效果廣泛關注。研究[11-13]發現:香菇多糖可導致線粒體去極化或激活非線粒體途徑中誘導細胞中活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成，引起人膀胱癌細胞T24凋亡；靈芝多糖可通過激活Caspase、線粒體和JNK通路，誘導結腸癌HCT-116細胞凋亡；人參多糖可通過調控MAPK/NF-κB/cyclin D1信號通路誘導細胞周期阻滯和凋亡，最終抑制K562細胞增殖。

Lane 1:Control group; Lane 2:1 g·L-1WGBP group; Lane 3:2 g·L-1WGBP group; Lane 4:5 g·L-1WGBP group.

圖4 各組CAL27細胞中pro-PARP和pro-Caspase-3蛋白表達電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of pro-PARP and pro-Caspase-3 proteins in CAL27 cells in various groups

我國是生產人參的大國，具有豐富的人參資源。隨著人參資源的深入開發，發現人參果也同樣具有很高的營養和藥用價值[14]。人參果是人參植株的人參 (PanaxginsengC.A.Meyer)的果實，主要含有皂苷、多糖、揮發油和生物堿等活性成分，具有抗疲勞、降血糖、抗衰老和抗腫瘤等多種功效，能提高機體對環境的適應能力和防御能力[15-17]。最近研究[10]發現：人參果多糖能顯著抑制人結腸癌HCT-116和HT-29細胞增殖；馮孟鑫[18]發現人參果多糖二級級分(WPGFH-0.04和WPGFH-0.8)在給藥量達到3 g·L-1時表現出較強的抑制肝癌HepG2細胞增殖的能力。然而目前的研究僅限于WGBP對腫瘤增殖抑制作用的基礎研究，并未深入探討WGBP抑制腫瘤細胞增殖的潛在機制。有關中藥多糖對OSCC的相關研究也少有報道。本研究利用人舌鱗癌CAL27細胞，從細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡等方面觀察WGBP對OSCC的抗腫瘤作用及潛在機制。

Caspase-3是凋亡反應的關鍵調控因子[19]。活化的Caspase-3可裂解DNA修復中重要的多聚(adp-核糖)聚合酶-1 (PARP-1)等蛋白，從而促進細胞凋亡[20]。有研究[21-23]表明：多種中藥多糖能通過激活下游的Caspase-3啟動子級聯，發揮其腫瘤殺傷效果，如茯苓多糖通過激活下游的Caspase-3誘導小鼠肉瘤180細胞凋亡，甘草根多糖可以激活Caspase-3和Caspase-9從而降解PARP誘導SCC-25細胞凋亡，以及當歸多糖通過上調促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase-3表達抑制U251細胞增殖。本研究結果顯示：WGBP可通過激活Caspase-3級聯反應以及降解PARP誘導CAL27細胞凋亡，表明在此過程中，Caspase-3是WGBP發揮細胞毒性的關鍵靶分子。研究[24]表明：WGBP主要由半乳糖和半乳糖醛酸組成，可能是一種阿拉伯半乳聚糖型果膠。在本實驗中該結果得到進一步驗證。此外，已有研究[25-27]表明：多糖的組成和結構與其抗腫瘤活性密切相關，如黨參多糖對HepG2細胞的抑制作用與其單糖種類有關,含有半乳糖醛酸較高的黨參多糖對HepG2細胞的抑制作用較強，不同組分的枸杞多糖可通過阻斷細胞周期的不同階段抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖。因此本文作者推測WGBP的抗腫瘤活性也可能與其單糖組成成分有關，具體的構效關系尚需進一步探究。

綜上所述， WGBP能誘導CAL27細胞發生G2/M期阻滯，通過激活Caspase-3引起級聯反應，降解PARP誘導細胞凋亡，最終發揮腫瘤殺傷效果，抑制CAL27細胞增殖且具有濃度依賴性。本研究結果將為開發以WGBP為主的功能性保健食品或治療OSCC藥物提供新的參考。