NIPA2通過JAK/STAT信號通路對高糖誘導的成骨細胞凋亡的調控作用及其機制

吳玉潔，邢學農

(中國科學技術大學附屬第一醫院 安徽省立醫院內分泌科， 安徽 合肥 230000)

糖尿病在世界范圍內表現出越來越高的發病率，并且患者的年齡也日趨年輕化。隨之而來的一系列糖尿病并發癥(糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變和糖尿病性骨質疏松癥等)也越來越多。在患者發生糖尿病的基礎上表現出骨質疏松的稱之為糖尿病性骨質疏松癥[1-2]。研究[3]顯示：有30% 以上的糖尿病患者會發生骨質疏松癥，60%以上的糖尿病患者存在低骨量。因此，研究糖尿病相關骨代謝并用于指導臨床治療尤為重要。普瑞德-威利/安格曼綜合征區域蛋白2(Prader-Willi/Angelman syndrome region protein 2, NIPA2)是一種鎂轉運蛋白，預測其有129個氨基酸和8個跨膜區域[4-5]。研究[6]顯示：NIPA2與糖尿病的發病風險具有明顯的相關性，但其具體作用機制研究甚少。Janus激酶/信號轉導子與轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號通路在細胞存活中具有重要的調控作用，參與很多疾病的發展，尤其是自身免疫疾病[7-9]。該通路在糖尿病腎病中的關鍵作用已有文獻[10]報道，但是其在糖尿病性骨病中的作用尚不清楚。本研究采用高糖誘導的成骨細胞，檢測細胞中NIPA2和JAK/STAT信號通路的表達，觀察敲減NIPA2、抑制JAK/STAT信號通路對高糖誘導的成骨細胞增殖和凋亡的影響，闡明NIPA2的作用機制，旨在為糖尿病性骨病的治療提供新的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器成骨細胞MC3T3-E1購自美國ATCC公司。α-MEM培養基、胎牛血清和噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和胰蛋白酶均購自美國Sellect公司，DMSO購自美國Sigma公司，AG490(用DMSO做溶劑)購自法國Gayman公司，LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒和逆轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，PVDF膜購自德國羅氏診斷有限公司， SDS-PAGE 試劑盒、ECL發光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。酶標儀購自美國Bio-Rad公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養將成骨細胞MC3T3-E1采用含10%胎牛血清的 α-MEM培養基，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中常規培養，待細胞生長至融合度約為75%時，用胰蛋白酶消化，進行傳代。

1.3 細胞處理和分組將正常培養的MC3T3-E1細胞隨機分為對照組、高糖(HG)組、HG+si-con組、HG+si-NIPA2組、HG+si-NIPA2+DMSO組和HG+si-NIPA2+AG490組。對照組：正常培養的MC3T3-E1細胞；HG組：將培養24 h的MC3T3-E1細胞采用26 nmol·L-1高糖處理24 h。將HG+si-con組、HG+si-NIPA2組、HG+si-NIPA2+DMSO組和HG+si-NIPA2+AG490(50 μmol·L-1)組按照脂質體LipofectamineTM2000說明書要求轉染MC3T3-E1細胞，轉染6 h后更換新鮮培養液繼續培養48 h，然后采用26 nmol·L-1高糖處理24 h，采用qRT-PCR法檢測轉染效率。轉染成功后，用于后續實驗。

1.4 qRT-PCR法檢測細胞中NIPA2 mRNA表達水平按照RNA抽提試劑盒說明書操作要求提取RNA，進行定量，然后按逆轉錄試劑盒說明書操作要求合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作要求進行NIPA2檢測。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt計算NIPA2 mRNA的表達水平。引物序列：NIPA2上游引物5′-CAGTTATGGTCATTCATGCTCCAA-3′，下游引物5′-TTAATATCAAGGCCACAATGACCAC-3′ ；GAPDH上游引物5′-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3′,下游引物5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′。

1.5 Western blotting法檢測細胞中NIPA2、P21、Cleaved caspase-3、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平RIPA蛋白裂解液對細胞進行冰上蛋白裂解1 h，提取總蛋白，以BCA法測定樣品蛋白的濃度。以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液(×5)，混勻，沸水浴變性10 min，離心取上清，進行SDS-PAGE蛋白電泳。然后，將蛋白濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌，4℃條件下，將封閉后的PVDF膜放入1∶ 1 000倍稀釋的一抗中反應過夜，以封閉液洗膜3次，每次5 min，再在37℃下將PVDF膜轉入1∶2 000倍稀釋的二抗中反應2 h。于暗室內ECL試劑盒顯影曝光，以GAPDH為內參，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.6 MTT法檢測細胞增殖活性將細胞制成混懸液，調整密度至1×104mL-1，然后接種至96孔板，取適量“1.3”中各組細胞，每孔加20 μL MTT溶液 (5 g·L-1) ，孵育4 h，終止培養，棄去培養液上清，然后每孔加150 μL DMSO，振蕩使結晶充分融解，在490 nm波長處檢測細胞吸光度(A)值。以A值表示細胞增殖活性。

1.7 Annexin Ⅴ- FITC/PI雙染檢測細胞凋亡采用 500 μL Binding Buffer懸浮細胞，分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC避光反應20 min后再加入5 μL PI避光反應20 min，用300目銅篩過濾，最后在1 h內上流式細胞儀，計算細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 2組成骨細胞中NIPA2 mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，HG組細胞中NIPA2 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.01)。見圖1和表1。

Lane 1: Control group；Lane 2: HG group.

Fig.1 Electrophoregram of expressions of NIPA2 protein in osteoblasts in two groups

表1 2組成骨細胞中NIPA2 mRNA和蛋白表達水平

GroupNIPA2 mRNANIPA2 proteinControl1.00±0.031.00±0.06HG0.32±0.03?0.21±0.02?t48.08337.473P<0.01<0.01

*P<0.01 compared with control group.

2.2 敲減NIPA2后2組成骨細胞中NIPA2、P21和Cleaved caspase-3蛋白表達水平及細胞增殖活性和細胞凋亡率與HG+si-con組比較，HG+si-NIPA2組成骨細胞中NIPA2蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，P21和 Cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，在48和72 h時細胞增殖活性明顯降低(P<0.01)，細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。見圖2、圖3和表2。

2.3 敲減NIPA2后2組成骨細胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平與HG+si-con組比較，HG+si-NIPA2組成骨細胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01)。見圖4和表3。

2.4 抑制JAK/STAT信號通路后各組成骨細胞中NIPA2、P21和 Cleaved caspase-3蛋白表達水平、細胞增殖活性及細胞凋亡率與HG+si-NIPA2+DMSO組比較，HG+si-NIPA2+AG490組成骨細胞中NIPA2蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，P21和Cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，在48和72 h時細胞增殖活性明顯升高(P<0.01)，細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。見圖5和表4。

Lane 1: HG+si-con group；Lane 2: HG+si-NIPA2 group.

圖2 2組成骨細胞中NIPA2、P21和 Cleaved caspase-3蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of NIPA2, P21, and Cleaved caspase-3 proteins in osteoblasts in varions groups

A: HG+si-con group；B: HG+si-NIPA2 group.

Fig.3 Apoptotic rates of osteoblasts in varions groups detected by flow cytometry

表2 敲減NIPA2后2組成骨細胞中NIPA2、P21和 Cleaved caspase-3蛋白表達水平及細胞增殖活性和細胞凋亡率

GroupProtein expression levelNIPA2P21Cleaved caspase-3Proliferation activity24 h48 h72 hApoptotic rate (η/%)HG+si-con1.00±0.071.00±0.051.00±0.040.24±0.020.41±0.030.72±0.066.57±0.35HG+si-NIPA20.43±0.04?2.34±0.16?3.23±0.03?0.23±0.010.32±0.03?0.51±0.04?16.56±0.02?t12.24613.84677.2501.3426.3648.73785.489P<0.01<0.01<0.010.198<0.01<0.01<0.01

*P<0.01 compared with HG+si-con group.

Lane 1: HG+si-con group；Lane 2: HG+si-NIPA2 group.

圖4 敲減NIPA2后2組成骨細胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of p-JAK2 and p-STAT3 proteins in osteoblasts in two groups after knockdown of NIPA2

3 討 論

NIPA2是一種高度選擇性的鎂離子轉運蛋白，目前已發現其與2型糖尿病有關，但其具體作用機制尚未明確。CHAN等[6]在研究中發現NIPA1的異常與美國女性糖尿病風險具有密切的相關性。ZHAO等[11]研究發現：NIPA2在成骨細胞中的表達水平與晚期糖基化終末產物(advanced glycosylationend products, AGEs) 呈劑量依賴性下調關系，且還可通過調節細胞內鎂離子的含量進一步影響成骨細胞的成骨能力，調節成骨細胞的凋亡，提示NIPA2是治療糖尿病骨質疏松癥的潛在靶點，但NIPA2對糖尿病骨質疏松癥的調控機制未做進一步研究。本研究采用qRT-PCR和Western blotting法檢測高糖誘導MC3T3-E1細胞中NIPA2表達發現：NIPA2表達明顯降低，再次證實了NIPA2在糖尿病性骨病中的表達下調；進一步研究通過敲減NIPA2后檢測高糖誘導的MC3T3-E1細胞增殖和凋亡發現：敲減NIPA2可抑制其增殖，促進凋亡，并上調P21和Cleaved caspase-3的蛋白表達，為NIPA2治療糖尿病骨病提供了更充分的理論依據。本研究結果顯示：敲減NIPA2可上調JAK/STAT信號通路中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達，為NIPA2的作用機制探究提供了新的依據。

表3 敲減NIPA2后2組成骨細胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平

GroupProtein expression levelp-JAK2p-STAT3HG+si-con1.00±0.051.00±0.03HG+si-NIPA23.56±0.05?4.43±0.04?t108.612205.800P<0.01<0.01

*P<0.01 compared with HG+si-con group.

Lane 1: HG+si-NIPA2 group；Lane 2: HG+si-NIPA2+DMSO group；Lane 3: HG+si-NIPA2+AG490 group.

圖5 抑制JAK/STAT信號通路后各組成骨細胞中NIPA2、P21和 Cleaved caspase-3蛋白表達電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of NIPA2, P21 and Cleaved caspase-3 proteins in osteoblasts in varions groups after inhibition of JAK/STAT signaling pathway

表4 抑制JAK/STAT信號通路后各組成骨細胞中NIPA2、P21和 Cleaved caspase-3蛋白表達水平、細胞增殖活性和細胞凋亡率

GroupProtein expression levelNIPA2P21Cleaved caspase-3Proliferation activity24 h48 h72 hApoptotic rate (η/%)HG+si-NIPA20.99±0.051.00±0.031.00±0.060.23±0.020.29±0.010.49±0.0317.12±1.02HG+si-NIPA2+DMSO1.00±0.081.01±0.070.99±0.040.22±0.020.30±0.010.50±0.0516.94±1.00HG+si-NIPA2+AG490 1.36±0.08?0.44±0.04?0.23±0.02?0.21±0.010.50±0.03?0.83±0.04?9.28±0.02?F78.412388.338940.6613.000344.455202.140264.985P<0.01<0.01<0.010.069<0.01<0.01<0.01

*P<0.01 compared with HG+si-NIPA2+DMSO group.

JAK/STAT信號通路在機體內普遍存在，其參與細胞的增殖、分化和凋亡等基本活動以及免疫的調節和腫瘤的進展過程[12-17]。研究[18-19]顯示：JAK/STAT信號通路在糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變和糖尿病神經病變中均具有重要的作用，本文作者推測其在糖尿病性骨病中也具有一定的作用。LIU等[20]研究顯示：JAK/STAT信號通路的失活在硫化氫(H2S)治療糖尿病大鼠心肌纖維化中具有重要的作用，提示JAK/STAT信號通路在糖尿病心肌炎中具有調控作用。MIKAMI等[21]研究發現：堿性磷酸酶和地塞米松可通過抑制JAK/STAT信號通路增強骨的形成能力。本研究結果顯示：在高糖誘導的成骨細胞中敲減NIPA2可明顯增強JAK/STAT信號通路的活性，抑制JAK/STAT信號通路可逆轉敲減NIPA2對高糖誘導成骨細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，說明不僅敲減NIPA2可調控JAK/STAT信號通路的活性，相反，JAK/STAT信號通路也可反向作用于NIPA2的表達及功能，揭示了NIPA2在糖尿病性骨病中的作用機制與 JAK/STAT信號通路的活性密切相關。

綜上所述，敲減NIPA2可抑制高糖誘導的成骨細胞增殖，促進凋亡，其機制可能與激活JAK/STAT信號通路有關，本研究結果為NIPA2在糖尿病骨病中作用的研究奠定了基礎。