miR-125b通過TLR4/NF-κB信號通路對心臟成纖維細胞增殖和遷移的影響

萬 琦，余寶剛

(河北醫科大學附屬唐山工人醫院急診內科，河北 唐山 063000)

心肌梗死發生心力衰竭的主要因素為心肌纖維化和心室重構的發展，抑制心肌成纖維細胞活化對延緩心肌梗死纖維化以及不良重塑過程具有重要意義。miRNA通過復雜的網絡調控心肌梗死后心肌纖維化和心室重構過程[1]。miR-125b具有多種生物學功能，研究[2]發現：miR-125b在成纖維細胞中表達水平升高，可促進心臟成纖維細胞增殖，參與心肌纖維化進程。炎癥反應在心肌纖維化的過程中具有重要作用，在炎性因子的作用下，心肌組織發生纖維化，心肌纖維化進一步促進炎性因子的分泌，形成惡性循環[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)是與炎癥反應關系密切的信號通路，Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是免疫系統與心血管疾病發展之間的橋梁，TLR4是其中與心血管疾病關系最密切的因子，是介導心肌炎癥的重要受體，其活化可增加NF-κB的表達量，引起一系列因子表達[4]。miR-125b和TLR4/NF-κB在心肌纖維化中的作用均已被證實，但miR-125b參與心肌纖維化進程是否與TLR4/NF-κB通路有關尚不十分清楚。本研究觀察miR-125b對心臟成纖維細胞增殖、遷移和TLR4/NF-κB信號通路的影響，探討miR-125b在心肌纖維化中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器心臟成纖維細胞系HEH2(上海心語生物科技有限公司)。兔抗人Ⅰ型膠原蛋白(type Ⅰcollagen,Col Ⅰ)單克隆抗體、兔抗人Ⅲ型膠原蛋白(type Ⅲ collagen,Col Ⅲ)單克隆抗體和兔抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體、兔抗人TLR4單克隆抗體和兔抗人NF-κB單克隆抗體(美國BPB公司)，逆轉錄聚合酶鏈式反應 (RT-PCR)試劑盒、反轉錄試劑盒、TRIzol試劑和ECL化學發光試劑盒(美國Santa Cruz公司)，MTT試劑、DMEM培養基、脂質體Lipofectamine 2000和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，陰性對照 inhibitors和miR-125b inhibitors[生工生物工程(上海)有限公司]。Multiskan FC酶標儀(美國Thermo公司)，PCR成像儀(型號JS-680D，上海培清科技有限公司), WB顯影儀(型號Tanon-5200，上海天能科技有限公司)，金屬浴(型號TU-100，上海一恒科技有限公司)。

1.2 HEH2細胞培養取液氮罐中的心臟成纖維細胞HEH2，快速轉移到37℃水浴中，待細胞完全融化后加入含胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM細胞生長液混勻，轉移到離心管中，1 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入DMEM懸浮細胞，將懸浮后細胞接種到細胞培養板中培養48 h。待細胞達90%以上融合時倒掉培養液，PBS洗滌，加入胰蛋白酶消化細胞，將消化后細胞移到離心管中，1 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入PBS洗滌細胞沉淀，加入DMEM培養液混勻后接種到培養板中培養。2 d傳代1次，取第3代細胞進行后續研究。

1.3 HEH2細胞分組和轉染將對數生長期的HEH2細胞隨機分為空白對照組、陰性對照組和miR-125b inhibitors組。將陰性對照inhibitors和miR-125b inhibitors加入到EP管中，加入100 μL無核酸酶水，分裝備用。將對數生長期的HEH2細胞加入胰蛋白酶消化，加入不完全培養液(不含FBS)，接種到細胞培養板中培養1 h，將陰性對照inhibitors和miR-125b inhibitors與不完全培養基混合均勻，靜置6 min，作為A液。將轉染試劑Lipofectamine 2000和不完全培養基混合均勻孵育20 min，作為B液，將A液和B液混合均勻。miR-125b inhibitors組HEH2細胞中加入含miR-125b inhibitors的混合液，陰性對照組HEH2細胞中加入含陰性對照inhibitors的混合液，空白對照組HEH2細胞不進行轉染。轉染后培養6 h后更換完全培養基(含FBS)繼續進行培養。

1.4 HEH2細胞中miR-125b水平測定取各組轉染后24 h的HEH2細胞，每組設7個復孔，加入TRIzol細胞裂解液裂解細胞，3 min后反復吹打細胞，將細胞裂解液轉移到新的EP管中，加入氯仿振蕩15 s，放置5 min后,12 000 r·min-1離心15 min，取上層水相層到新的EP管中，加入異丙醇混勻，靜置10 min，12 000 r·min-1離心15 min，棄去上清液，加入乙醇混勻，10 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入DEPC溶解RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，將RNA反轉錄合成miR-125b的cDNA，采用RT-PCR法測定細胞中miR-125b水平，PCR反應條件：95℃、30 s，95℃、5 s，58℃、30 s，共42個循環。以2-ΔΔCt法計算細胞中miR-125b水平。

1.5 HEH2細胞增殖活性測定取各組轉染后HEH2細胞培養至對數生長期，每組設7個復孔，在細胞中加入胰蛋白酶消化細胞，1 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，在細胞沉淀中加入培養液將細胞密度調整為5×104mL-1，接種到96孔細胞培養板中培養，每天在每孔中加入20 μL MTT溶液孵育4 h，吸去上清液，加入DMSO溶液混勻，酶標儀測定每孔吸光度(A)值,以A值表示細胞增殖活性。

1.6 HEH2細胞遷移能力測定取各組轉染后HEH2細胞培養至對數生長期，每組設7個復孔，細胞中加入胰蛋白酶消化細胞，加入不含FBS的培養液，接種到細胞培養板中培養24 h。取Transwell小室，在上室中加入不含FBS的培養液，下室加入含FBS的培養基孵育1 h，收集HEH2細胞，將細胞濃度調整為2×105mL-1，取100 μL細胞懸液加入到Transwell小室上室，將600 μL含FBS的DMEM培養液加入到小室下室，孵育4 h，小室上層膜用PBS洗滌，甲醛固定，結晶紫染色，棉簽擦掉附著細胞，觀察細胞遷移情況，計數遷移細胞數。

1.7 HEH2細胞中Col Ⅰ、Col Ⅲ、α-SMA、TLR4和NF-κB蛋白表達水平測定取各組轉染48 h的細胞，每組設7個復孔，在細胞中加入裂解液，冰上裂解30 min，10 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉移到新的EP管中，采用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白樣品和Loading Buffer混合，在100℃孵育器上孵育5 min使其變性，取50 μL蛋白樣品加入上樣孔中，電泳30 min，經轉膜、封閉，加入一抗過夜孵育，以β-actin為內參照，加入二抗封閉1 h，化學發光，顯影，采用FluorChem Q多功能成像和分析系統采集圖像，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 結 果

2.1 各組HEH2細胞中miR-125b水平miR-125b inhibitors組HEH2細胞中miR-125b水平(0.41±0.06)低于空白對照組(0.00±0.08)和陰性對照組(0.97±0.09)(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組HEH2細胞中miR-125b水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組HEH2細胞增殖活性培養1、3和5 d后miR-125b inhibitors組HEH2細胞增殖活性低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組HEH2細胞增殖活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組HEH2細胞增殖活性

GroupProliferation activity(t/d) 135Blank control 0.153±0.0120.584±0.0181.184±0.036Negative control 0.151±0.0100.579±0.0191.178±0.034MiR-125b inhibitors 0.132±0.009?△0.423±0.016?△0.745±0.028?△F8.680187.021411.267P0.002<0.01<0.01

*P<0.05 compared with blank control group;△P<0.05 compared with negative control group.

2.3 各組HEH2細胞遷移數miR-125b inhibitors組HEH2細胞遷移數(56.47±11.04)低于空白對照組(114.21±15.02)和陰性對照組(112.16±14.23)(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組HEH2細胞遷移數比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1(插頁三)。

2.4 各組HEH2細胞中ColⅠ、Col Ⅲ和α-SMA蛋白表達水平miR-125b inhibitors組HEH2細胞中ColⅠ、Col Ⅲ和α-SMA蛋白表達水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組HEH2細胞中ColⅠ、Col Ⅲ和α-SMA蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2和圖2。

表2 各組HEH2細胞中ColⅠ、Col Ⅲ和α-SMA蛋白表達水平

GroupCol Ⅰ Col Ⅲ α-SMA Blank control 0.34±0.080.27±0.040.75±0.12Negative control 0.35±0.070.28±0.050.77±0.13MiR-125b inhibitors 0.18±0.05?△0.11±0.03?△0.38±0.11?△F13.84838.22023.339P<0.01<0.01<0.01

*P<0.05 compared with blank control group;△P<0.05 compared with negative control group.

Lane 1：Blank control group;Lane 2：Negative control group;Lane 3：MiR-125b inhibitors group.

圖2 各組HEH2細胞中Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of Col Ⅰ,Col Ⅲ and α-SMA proteins in HEH2 cells in various groups

2.5 各組HEH2細胞中TLR4和NF-κB蛋白表達水平miR-125b inhibitors組HEH2細胞中TLR4和NF-κB蛋白表達水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組HEH2細胞中TLR4和NF-κB蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3和圖3。

3 討 論

急性心肌梗死是冠狀動脈急性缺血或者血流中斷引起的心肌壞死，心肌梗死進展為心力衰竭的重要病理過程為心室重構，心室病理性重構為心肌細胞和細胞外基質發生適應不良性改變所引起，包括心室形態、組織結構、大小和功能狀態的改變，心室病理性重構是影響心肌梗死預后的主要因素[5]。

表3 各組HEH2細胞中TLR4和NF-κB蛋白表達水平

GroupTLR4 NF-κBBlank control 0.73±0.160.27±0.06Negative control0.71±0.180.29±0.05MiR-125b inhibitors 0.12±0.05?△0.14±0.04?△F41.68818.091P<0.01<0.01

*P<0.05 compared with blank control group;△P<0.05 compared with negative control group.

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group；Lane 3：MiR-125b inhibitors group.

圖3 各組HEH2細胞中TLR4和NF-κB蛋白表達電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of TLR4 and NF-κB proteins in HEH2 cells in various groups

心肌纖維化的關鍵效應細胞為心臟成纖維細胞，心臟成纖維細胞在心肌細胞外基質形成中具有關鍵性作用，心肌纖維化加速的重要機制為心臟成纖維細胞的增殖和活化。心肌梗死后心肌細胞分泌白細胞介素1、白細胞介素6和腫瘤壞死因子α等促炎性細胞因子，并分泌去甲腎上腺素和血管活性因子等多種因子，影響心臟成纖維細胞與其分化為肌成纖維細胞之間的平衡狀態，使心臟成纖維細胞分化成肌成纖維細胞，使其處于活化狀態[6]。肌成纖維細胞特征性分泌α-SMA蛋白，并且具有更強的分泌ColⅠ和Col Ⅲ的能力，Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA是引起心肌纖維化的主要原因[7]。因此抑制心臟成纖維細胞增殖和活化是減輕心肌梗死后心肌纖維化及心室不良重構的關鍵。

miRNA是無編碼功能的單鏈小分子RNA，由約22個核苷酸組成，在各種生物體中廣泛存在，可通過與靶基因的mRNA 3′非編碼區互補配對，通過形成RNA誘導的沉默復合體促進靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，對靶基因的表達發揮負調控作用，抑制其表達，從而發揮生物學作用[8-9]。在心肌梗死后心力衰竭的進程中存在miRNA的異常表達和慢性炎癥激活，miRNA通過與mRNA靶點部分結合，在轉錄水平上抑制蛋白的合成，從而參與心力衰竭的炎癥通路過程，調節心肌肥大和心力衰竭等心臟疾病的發生發展過程[10]。miR-125b在多種疾病的發生發展中發揮作用[11-13]，在惡性腫瘤中發揮癌基因和抑癌基因作用，在惡性腫瘤組織中高表達可通過促進腫瘤細胞增殖和遷移、抑制抑癌基因活性和腫瘤細胞凋亡發揮癌基因作用；miR-125b在乳腺癌和肺癌等組織中低表達，發揮抑癌基因作用[14-15]。miR-125b在心肌纖維化進程中也發揮重要作用[11]。沈志方等[16]研究發現：miR-125b可通過TGF-β1/Smad信號通路參與心肌纖維化進程；別自東等[17]通過對心肌梗死模型小鼠研究發現：miR-125b通過作用于分泌型卷曲相關蛋白5調節急性心肌梗死后心室重構。本研究結果顯示：下調HEH2細胞中miR-125b水平可抑制HEH2細胞的增殖和遷移能力，降低細胞中Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA蛋白表達水平。本研究結果與上述研究結果一致，表明下調miR-125b水平可抑制心臟成纖維細胞增殖和遷移，抑制心臟成纖維細胞活化，從而抑制心肌纖維化進程。

心肌梗死后心力衰竭過程存在慢性炎癥激活，TLR4/NF-κB信號通路在心力衰竭炎癥中被廣泛研究[18]。白細胞介素和腫瘤壞死因子等促炎細胞因子參與心力衰竭的炎癥反應過程，多種促炎因子和TLR4/NF-κB等信號通路導致心肌細胞凋亡、纖維化和心肌細胞肥大，炎癥反應激活、炎癥通路中間因子激活與疾病進展之間形成復雜的病理網絡，最終引起心肌功能減退，引起心力衰竭的發生[19-20]。miRNA通過抑制蛋白合成參與心肌梗死后心力衰竭的炎癥通路過程，從而調節心力衰竭的發生發展過程。miR-125b是否通過TLR4/NF-κB信號通路調控心肌纖維化的發生尚不十分清楚，本研究結果顯示：下調miR-125b水平可降低心臟成纖維細胞中TLR4和NF-κB蛋白表達水平，表明下調miR-125b可抑制HEH2細胞中NF-κB信號通路的激活。下調miR-125b可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制促炎細胞因子的分泌和炎性反應的激活，從而抑制心臟成纖維細胞的增殖和活化、心肌纖維化進程及心肌重構和心力衰竭的發生發展。

綜上所述，下調心臟成纖維細胞中miR-125b水平可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制細胞增殖和活化，本研究為心肌纖維化的治療提供了新的思路。但本研究僅探討了下調miR-125b對TLR4/NF-κB信號通路的影響，有關miR-125b對TLR4/NF-κB信號通路及其下游炎性因子的具體調控過程需進一步深入研究。