TP53 G199X 和 V157fs點(diǎn)突變對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞功能的影響

聶 蔓，岳 軍

(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)教研室，四川 成都 610072)

卵巢癌(ovarian cancer, OC)是女性常見的五大癌癥之一，并且是導(dǎo)致女性死亡的第一位生殖系統(tǒng)癌癥[2]。20%～25%卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素有關(guān)[3]。癌癥基因組研究計(jì)劃[4]研究顯示：在96%的卵巢癌腫瘤組織中存在TP53基因突變。TP53是人類的一個(gè)重要的抑癌基因，其失活在腫瘤的形成和發(fā)展過程中起著重要的作用[5]。當(dāng)TP53基因發(fā)生突變后，所對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞的生長、凋亡和DNA修復(fù)的調(diào)節(jié)功能部分或完全喪失。TP53基因由此從一個(gè)抑癌基因轉(zhuǎn)變成一個(gè)致癌基因[6]。研究[7]顯示：TP53基因的R273H、R248Q、R175H和R248W點(diǎn)突變?yōu)闊狳c(diǎn)突變，在膀胱癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、喉癌和皮膚癌等多種癌癥中是突變頻率最高的4個(gè)點(diǎn)突變。根據(jù)本文作者前期的全外顯子測序和Sanger測序結(jié)果，本研究在TP53基因中篩選出了6個(gè)點(diǎn)突變，其中4個(gè)點(diǎn)突變?yōu)闊狳c(diǎn)突變，還有2個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變，即G199X和V157fs。G199X是終止突變，V157fs是移碼突變。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)致病候選基因TP53進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，探討TP53 G199X 和 V157fs點(diǎn)突變對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞蛋白表達(dá)、增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人卵巢癌細(xì)胞株A2780購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。野生型TP53質(zhì)粒和空載體購自長沙優(yōu)寶生物科技有限公司，Q5點(diǎn)突變?cè)噭┖匈徸悦绹鳱EB公司，培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自烏拉圭Cell-Box公司，青鏈霉素混合液購自美國Gibco公司，Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司，小鼠抗P53單抗購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗GAPDH單抗和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑購自美國Boster公司，基質(zhì)膠購自美國Corning公司。Fusion FX7光譜儀購自法國Vilber公司，Model 680酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，Olympus IX71 倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建2個(gè)突變型TP53質(zhì)粒G199X和V157fs使用Q5點(diǎn)突變?cè)噭┖性趯?shí)驗(yàn)室進(jìn)行合成并進(jìn)行測序驗(yàn)證。突變引物：G199X 正向引物5′-CGAGTGGAAtGAAATTTGCG-3′,反向引物5′-ATAAGATGCTGAGGAGGG-3′； V157fs正向引物5′-TCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAG-TCAC-3′，反向引物5′-ACGCGGGTGCCGGGCG-GG-3′。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染使用常規(guī)手段維持細(xì)胞生長：濕潤環(huán)境，37℃恒溫，5%CO2。完全培養(yǎng)基由90%DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液組成。當(dāng)細(xì)胞生長至80%的密度時(shí)，根據(jù)操作說明使用Lipofectamine 3000將野生型、2個(gè)突變型和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。

1.4 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染相關(guān)的質(zhì)粒后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h。使用細(xì)胞裂解緩沖液(1×磷酸鹽緩沖液+1%蛋白酶抑制劑混合物)提取細(xì)胞總蛋白。使用15%的超聲強(qiáng)度促進(jìn)細(xì)胞的進(jìn)一步裂解，蛋白溶液使用二喹啉甲酸試劑測定總蛋白濃度。然后以1∶3的比例加入上樣緩沖液，用金屬浴95℃加熱10 min。冷卻后加樣到10% SDS-PAGE凝膠電泳直至目標(biāo)條帶清晰分離。然后使用半干法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)上。脫脂牛奶封閉膜30 min后，加入一抗P53，在4℃條件下反應(yīng)過夜。第2天使用TBST緩沖液清洗NC膜3次，每次5 min。再加入二抗溶液室溫孵育1～2 h。之后用TBST緩沖液清洗3次，每次5 min。曝光液A和曝光液B以體積比1∶1 配置，混勻后均勻滴加于NC膜上。使用Fusion FX7光譜儀暗室曝光后顯影并采集蛋白條帶圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞增殖活性細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h。細(xì)胞經(jīng)消化、離心、重懸后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將調(diào)整好數(shù)目的細(xì)胞懸液100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，每組4孔。將 96 孔培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中4 h使其貼壁，然后每個(gè)孔加入10 μL CCK-8溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，采用Model 680 酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量溶液0、12、24、36和48 h時(shí)的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。以A值表示細(xì)胞增殖活性。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞劃痕愈合率用Marker筆在6孔板背后均勻地劃橫線，每孔3條。將細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至80%的密度時(shí)，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒并放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。然后使用10 μL 的移液槍槍頭按照直尺垂至于背后的橫線劃線，每孔3條，采用PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，加入無血清培養(yǎng)基以防止細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，使用Olympus IX71 倒置顯微鏡于0、12、24和48 h時(shí)觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。使用Image J軟件測定劃痕愈合率。劃痕愈合率=(當(dāng)前時(shí)間點(diǎn)空白面積-上一時(shí)間點(diǎn)空白面積)/上一時(shí)間點(diǎn)空白面積×100%。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組侵襲細(xì)胞數(shù)用無血清培養(yǎng)基以1∶8的比例稀釋基質(zhì)膠，然后將混合液鋪滿Transwell小室上室的底部，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱4 h使其凝固。細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h。細(xì)胞經(jīng)消化、離心，用無血清培養(yǎng)基重懸后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將調(diào)整好數(shù)目的細(xì)胞懸液100 μL接種于小室上室。小室下室加入600 mL含20%血清的培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。取出Transwell小室，用棉棒擦去上室中的培養(yǎng)基和基質(zhì)膠，采用PBS緩沖液沖洗1次，用甲醇固定細(xì)胞30 min。將小室適當(dāng)風(fēng)干后，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，再用PBS緩沖液沖洗1次。使用Olympus IX71 倒置顯微鏡隨機(jī)尋找10個(gè)視野觀察細(xì)胞并拍照，使用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2 結(jié) 果

2.1 各組A2780細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)情況轉(zhuǎn)染野生型TP53基因的A2780細(xì)胞中P53蛋白有表達(dá)，而轉(zhuǎn)染2個(gè)突變型和空載體質(zhì)粒的細(xì)胞中無P53蛋白的表達(dá)。見圖1。

Lane 1: Wild-type group; Lane 2: G199X group; Lane 3: V157fs group; Lane 4: Empty vector group.

圖1 各組A2780細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of P53 protein in A2780 cells in various groups

2.2 各組A2780細(xì)胞增殖活性A2780細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的12、24、36和48 h時(shí)2個(gè)突變型組和空載體組A2780細(xì)胞增殖活性明顯高于同一時(shí)間點(diǎn)野生型組(P<0.01)。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組A2780細(xì)胞增殖活性

GroupProliferation activity of A2780 cells(t/h) 12243648Wild-type0.482±0.0330.764±0.0570.973±0.0711.144±0.081G199X0.815±0.091?1.355±0.020?1.772±0.021?2.084±0.028?V157fs0.701±0.029?1.207±0.012?1.584±0.003?1.865±0.012?Empty vector0.723±0.045?1.197±0.029?1.510±0.039?1.761±0.030?

*P<0.01 compared with wild-type group.

2.3 各組A2780細(xì)胞劃痕愈合率與野生型組(14.730%±1.937%)比較，G199X組(34.850%±1.703%)和 V157fs 組A2780細(xì)胞劃痕愈合率(20.590%±0.534%)明顯升高(P<0.05或P<0.01)，但空載體組劃痕愈合率(13.610%±1.122%)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組A2780細(xì)胞遷移情況

2.4 各組A2780細(xì)胞侵襲數(shù)與野生型組(32.700±2.161)比較，G199X組(130.200±4.114)、V157fs組(104.200±2.969)和空載體組侵襲細(xì)胞數(shù)(84.700±5.416)均明顯升高(P<0.01)。見圖3(插頁三)。

3 討 論

TP53基因在預(yù)防腫瘤發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。野生型TP53基因可能會(huì)因在致癌或遺傳毒性條件下通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期凋亡或停滯過程而被激活以抑制腫瘤細(xì)胞的生長[8]。超過50%的腫瘤組織中會(huì)有TP53的體細(xì)胞突變[9]，突變體TP53不僅失去了腫瘤抑制功能，還獲得了促進(jìn)腫瘤發(fā)生的新轉(zhuǎn)化能力[10]。有研究[11]顯示：核磷酸肌醇信號(hào)對(duì)p53的穩(wěn)定性起著重要的調(diào)控作用。而另一研究[12]顯示一些微小RNA與原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中TP53表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。研究[13]顯示：R273和G245是IARC數(shù)據(jù)庫中最常見的2個(gè)突變點(diǎn)。現(xiàn)已經(jīng)證明這2種突變消除了野生型TP53基因的功能，包括TP53介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，以及通過調(diào)節(jié)一些下游基因促進(jìn)腫瘤發(fā)生。錯(cuò)義突變可能將TP53基因從腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)化為致癌基因，因此了解突變TP53基因功能活性的獲得具有重要的科學(xué)和臨床意義[14]。

研究[15]顯示：突變會(huì)產(chǎn)生特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)變化，突變P53蛋白通常在腫瘤中以極高水平積累，這部分是由于鼠雙微基因2(murine double minute,MDM2)反式激活的破壞，MDM2作為負(fù)反饋環(huán)，在無DNA損傷信號(hào)的情況下下調(diào)P53蛋白水平并維持野生型 P53在正常組織中處于低水平的狀態(tài)。KANG等[16]集中于2個(gè)高頻突變(TP53 G245C和R273H)研究其在ESCC細(xì)胞系、p53缺陷細(xì)胞系H1299和HCT116 p53-/-中的致癌作用，結(jié)果表明突變體TP53 G245C和R273H可導(dǎo)致更具攻擊性的表型并增強(qiáng)癌細(xì)胞惡性度。DONG等[17]通過轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HHUA產(chǎn)生了穩(wěn)定共表達(dá)野生型TP53、R273H顯性陰性突變體TP53和R213Q隱性突變體TP53，然后進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明R273H突變體可通過增加HHUA細(xì)胞的侵襲和遷移來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。CHEN等[18]研究發(fā)現(xiàn)P53的Ser392磷酸化會(huì)使年輕個(gè)體的腫瘤生長速度加快。這些研究均表明發(fā)生了突變的TP53基因會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性程度，提示TP53基因突變與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。

綜上所述，本文作者通過全外顯子測序結(jié)合Sanger測序結(jié)果在臨床卵巢癌患者的樣本中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)點(diǎn)突變，并研究了其在卵巢癌A2780細(xì)胞中的致癌作用。TP53 G199X和V157fs 2個(gè)點(diǎn)突變會(huì)終止P53蛋白在A2780細(xì)胞中的表達(dá)并促進(jìn)卵巢癌A2780細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲功能。本研究進(jìn)一步揭示了TP53基因在癌癥發(fā)生中的作用，并可能有助于由于TP53基因突變引起癌癥的臨床診斷和治療。本研究還表明了2個(gè)突變的不同生物學(xué)特性，G199X突變的細(xì)胞較V157fs細(xì)胞更具惡性，但其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是否能夠發(fā)揮同樣作用還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)明確,且本研究測序樣本量較少，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。