姜黃素預處理對急性缺血再灌注模型大鼠肝臟的保護作用

周亞賓，華 進，戚伶俐，代 露，龐曉麗

(1.四川輕化工大學生物工程學院,四川 宜賓644000;2.吉林大學第一醫院小兒消化科，吉林 長春130021)

肝臟缺血再灌注多見于肝臟嚴重創傷手術、肝臟腫瘤切除和肝臟移植術等臨床情況[1]。肝臟缺血再灌注的損傷機制涉及自由基損傷、脂質過氧化、細胞內鈣超載和細胞凋亡等多環節[2-3]。肝臟缺血再灌注可使肝代謝解毒功能降低，微循環阻力升高，嚴重者可導致肝功能衰竭，并直接影響到手術成功率和患者存活率。如何保護缺血的肝細胞、減少肝臟缺血再灌注的發生是亟待解決的重要課題。近年來研究[4-6]表明：姜黃素對重要器官(腸和腦)缺血再灌注有保護作用。然而研究主要集中在心肌、腦、腎和腸等器官，對肝臟的保護研究[7]較少。姜黃素是從姜科姜黃屬姜黃根莖中提取的一種酚類色素[8]，其具有潛在的抑制細胞凋亡、抗氧化和抗炎癥的作用[9-11]。本實驗通過建立姜黃素預處理的大鼠急性肝臟缺血再灌注模型，采用超高效液相色譜-質譜(ultra performance liquid chromatography-mass specteum, UPLC-MS) 聯用法、膽管導管術和熒光分析檢測法檢測大鼠血清中姜黃素水平、大鼠膽汁分泌量和大鼠肝臟組織中丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平，探討姜黃素對大鼠肝臟缺血再灌注保護作用的有效性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器Sprague-Dawlley(SD)大鼠10只，體質量200～300 g，雌雄不限，購自成都達碩生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(川)2015-030; 室內飼養條件為22℃，相對濕度65%，光照周期12 h∶12 h (L∶D)。姜黃素(C1386)和羧甲基纖維素鈉(CMC)(C9481)購于美國Sigma公司；MDA試劑盒(Cat#10010263)購于美國Cayman公司。動物麻醉呼吸機(AAS Iso Tec 5, 美國Datex-Ohmeda GE Healthcare公司)， 手術顯微鏡(西德Carl Zeiss公司)，離心機 (Eppendorf 5417R，美國Eppendorf公司)，UPLC-MS(美國 Waters公司)，均質機(Precellys 24，法國Bertin Technologies公司)，熒光分析儀(2030 Multilabel Reader, 美國PerkinElmer公司)

1.2 實驗動物分組將SD大鼠隨機分為實驗組(4只大鼠，手術前90 min腹腔注射200 mg·kg-1姜黃素和1%CMC)、溶劑對照組(3只大鼠，手術前90 min腹腔注射1%CMC)和假手術組 (3只大鼠,術前不做處理)。

1.3 膽管導管術將大鼠接上動物麻醉呼吸機進行異氟烷(2%)麻醉后，將大鼠仰臥于手術臺上并固定四肢，從腹部備皮，暴露腹中線。采用70%酒精消毒大鼠腹部后，沿腹中線至劍突做切口，暴露腹腔。將肝臟輕輕翻起，在手術顯微鏡下分離出膽總管，對大鼠實施膽管導管術，在膽總管靠近十二指腸處剪開小切口，插入聚乙烯導管[外直徑(OD) 0.8 mm, 內直徑(ID) 0.5 mm]，向上直至肝總管，用細繩綁緊插入膽總管的聚乙烯導管，隨后收集肝臟左外側葉、左內側葉和中葉分泌的膽汁。見圖1(插頁三)。

1.4 急性肝臟缺血再灌注模型建立采用無損傷止血夾夾閉大鼠肝臟左葉和中葉的肝動脈和門靜脈造成急性肝缺血(左葉和中葉，占肝總量的60%～70%)[12]。45 min后，釋放結扎使肝臟再灌注60 min，隨后心臟取血并摘取肝組織。

實驗組：大鼠腹腔注射溶于1%CMC的姜黃素，在注射50 min后用已氟醚將動物麻醉，并在麻醉10 min后開始進行膽管導管術和大鼠尾部取血，在姜黃素注射后70 min時開始收集膽汁。膽汁收集時間為125 min，每隔5 min收集一管，先收集20 min膽汁作為基線，然后從20 min開始使用無損傷止血夾結扎血管造成缺血，45 min后釋放結扎血管造成血液再灌注，再灌注進行60 min，然后停止膽汁收集，進行大鼠心臟取血并摘取肝臟。溶劑對照組：大鼠腹腔注射1%CMC，其余實驗步驟與實驗組相同。假手術組：大鼠不進行任何藥物注射的情況下采用已氟醚麻醉，并在麻醉10 min后開始進行膽管導管術和大鼠尾部取血，在麻醉后20 min時開始收集膽汁。膽汁收集時間為125 min，在此期間只進行膽汁收集，不引發急性肝缺血和血液再灌注。在停止膽汁收集后進行大鼠心臟取血并摘取肝臟。根據每5 min收集的膽汁計算膽汁流量，以 μL·g-1·min-1為單位。以第1個20 min的膽汁流量平均值為基線(作為100%)，把每個時間點的膽汁流量表達為基線值的百分數作為最后的結果。

1.5 UPLC-MS法檢測大鼠血清中姜黃素水平大鼠尾部靜脈取血0.5 mL,心臟取血2 mL。以3 000 r·min-1、4℃離心10 min，取血清。隨后采用UPLC-MS法檢測大鼠血清中姜黃素水平(mg·L-1)。

1.6 大鼠肝臟組織中MDA水平檢測取大鼠肝臟組織，按照MDA試劑盒說明書方法檢測大鼠肝組織中MDA水平，單位為μmol·g-1。

2 結 果

2.1 大鼠腹腔注射姜黃素后吸收情況實驗組大鼠姜黃素腹腔注射后，打開大鼠腹腔可見在腹膜內和胃腸道漿膜外有黃色的姜黃素，表明姜黃素成功注射入大鼠腹腔中，見圖2(插頁三)。在腹腔中的姜黃素會被較快地吸收并進入大鼠血液。

2.2 實驗組大鼠血清姜黃素水平在大鼠腹腔注射200 mg·kg-1姜黃素1和3 h后，采用UPLC-MS法檢測實驗組大鼠血清姜黃素水平, 結果顯示：注射后1 h大鼠血清姜黃素水平為(0.17±0.05) mg·L-1, 但在注射3 h后，血清姜黃素水平在檢測線以下。

2.3 各組大鼠膽汁流量在導管接入膽管后，假手術組大鼠顯示膽汁流量基本保持在基線值附近，無明顯變化。實驗組大鼠在結扎血管制造缺血后膽汁分泌量迅速降低至0，在結扎血管釋放進行血液再灌注后，膽汁流量緩慢增加，在約60 min后達到最高點，約為基線值40%。溶劑對照組大鼠膽汁流量在缺血再灌注后的前3個時間點恢復水平略低于實驗組，但差異不明顯，在其余時間點其變化趨勢和流量水平與實驗組基本一致，膽汁流量最高點達到基線值的40%。見圖3。

A:Sham operation group;B:Solvent control group and Curcumin group.

圖3 各組大鼠肝臟缺血再灌注后膽汁流量

Fig.3 Bile flows of rats in various groups after liver ischemia-reperfusion

2.4 各組大鼠肝臟組織中MDA水平缺血再灌注后，假手術組大鼠肝臟中MDA水平為(162.73±90.50)mmol·g-1；實驗組大鼠肝臟組織中MDA水平最低，為(9.18±1.78)mmol·g-1；溶劑對照組大鼠肝臟中MDA水平最高，為(527.54±237.38)mmol·g-1，約為實驗組的57倍、假手術組的3倍，但差異無統計學意義(P>0.05)；假手術組大鼠肝臟中MDA水平約為實驗組的18倍，但差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

缺血再灌注損傷是肝臟移植手術中造成肝損傷的重要原因之一[13]。研究[14]顯示：肝臟在缺血狀況下會產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)枯竭，產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，且在再灌注后進一步惡化。姜黃素是姜黃的提取物，來源廣，無毒。在過去五十余年的研究中證實姜黃素是姜黃中最主要的功能性物質，抗氧化是其重要的功能之一[15]。姜黃素作為一種有護肝作用的物質，其護肝機制被認為是其抗氧化、降低ROS和脂質過氧化、抗炎癥和抗纖維化[16]。作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸反應的代謝產物，MDA能反映體內脂質過氧化水平[17]。本研究結果顯示：與溶劑對照組比較，實驗組大鼠肝臟組織中 MDA水平明顯降低，溶劑對照組大鼠肝組織中MDA水平是實驗組的57倍。這與姜黃素的抗氧化、降低ROS和脂質過氧化的功能相符。 雖然使用Student T雙尾檢驗值為0.09，大于0.05，在統計學意義上不具備顯著差異性，這有可能由如下原因造成：一是兩組樣品均數的標準誤差值都高，尤其是溶劑對照組；二是由于本研究使用的動物數量較少。本研究結果顯示：假手術組大鼠肝臟組織中的MDA水平約為實驗組的18倍，與本文作者的預期不符。本文作者預期實驗組MDA水平應接近假手術組，這表明姜黃素在肝臟中能有效降低脂質的過氧化水平。

膽汁是由肝實質細胞分泌的。膽汁流能反應肝臟功能的狀態，并被作為缺血再灌注引起的肝功能受損的指標。結扎血管造成肝臟缺血的情況下，膽汁分泌下降直到膽汁流量為0，取消血管結扎，造成血液再灌注，膽汁分泌恢復，理想狀態下，肝臟未受到損傷，膽汁流量應該回升到缺血再灌注前的水平。但在實際中缺血再灌注會造成肝臟功能受損從而導致膽汁流量降低，因此在缺血再灌注后膽汁流量通常明顯低于再灌注前。本研究中假手術組大鼠膽汁流量在整個125 min收集時間段中保持在基線附近，表明在整個手術過程中肝臟功能未受到損傷，膽管導管術本身不會影響膽汁流量。實驗組大鼠膽汁流量在缺血再灌注后恢復到基線的40%左右，但實驗組與溶劑對照組在此階段的膽汁流量無明顯差異，實驗組膽汁流量未如預期較對照組明顯提高，這可能是在給藥80 min后即進行缺血再灌注(注射1 h后進行手術，再經過20 min的基線測量進入缺血再灌注)，時間過短，姜黃素還未在肝臟充分發揮作用。一方面，作為肝功能的一項指標，膽汁流量取決于膽汁酸轉運蛋白的活性、肝實質細胞內ATP含量、細胞內鈣離子通道和其他相關的信號通路的作用。雖然在本實驗時間內，姜黃素已通過其抗氧化性明顯降低肝組織中MDA水平，但要使姜黃素通過對上述影響膽汁流量的因素中一至數個因素產生作用以提高膽汁流量，可能需要更長的時間。有探討姜黃素作用的研究[18-19]采取每日給藥并持續數周時間。 另一方面，姜黃素具有生物利用率低和降解快的特點[20-22]。本研究結果顯示：200 mg·kg-1姜黃素腹腔給藥后3 h，未能在血清中檢測到姜黃素。另有研究[23]認為姜黃素的某些代謝產物與其生物活性類似且更穩定和更容易吸收，其對肝臟的保護作用主要是來自其有活性的代謝產物。因此，在動物實驗中如能增加姜黃素的吸收并增加其在血液中的濃度，或通過持續給藥等其他方法，保持姜黃素或其有生物活性的代謝產物在血液中的濃度，可能會取得更好的保護肝臟的效果，并增加缺血再灌注后的膽汁流量。姜黃素不溶于水，但溶于堿性溶液和pH值低的溶液(如冰醋酸)[24]，把姜黃素混合在1%的食品添加劑CMC中[25]，再使用均質器進行均質，進而獲得均勻的姜黃素懸浮液, 同時采用腹腔注射的方式，這樣有利于姜黃素在大鼠體內的吸收[26]。本實驗獲得了姜黃素對缺血再灌注損傷肝臟保護的部分正面預期，為了取得更全面和確實的實驗數據，可以在后續的實驗中適當增加實驗動物樣本量。

綜上所述，姜黃素預處理急性缺血再灌注的大鼠肝臟能有效抑制大鼠肝臟中MDA水平升高，對肝臟起到一定的保護作用。由于本實驗中姜黃素預處理時間過短，并且未能持續給藥以保持其在血液中的濃度，對恢復膽汁分泌效果不明顯。