大黃酸對非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其機制

和瑩瑩，薛金慧，趙 娜

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院病理科,河南 鄭州 450007)

肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數的80%[1-3]。NSCLC具有難發現、易轉移和高復發的特點，雖然手術聯合放化療和靶向治療在NSCLC中取得了一定效果，但晚期患者生存率偏低[4-7]，同時現有治療手段和藥物均伴有嚴重的不良反應，明顯降低患者的生存質量[8]，采用高效且低毒的藥物治療是近年來NSCLC臨床研究的焦點。大黃酸是中藥大黃的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎和抗菌等多種藥理活性[9-12]。研究[13-16]表明：大黃酸具有抗癌作用，其作用機制主要包括促進細胞凋亡、抑制細胞增殖和抑制細胞遷移及侵襲。目前國內外關于大黃酸對抗NSCLC增殖和抗轉移作用的研究未見報道。本研究選擇NSCLC A549細胞作為研究對象，通過檢測大黃酸對A549 細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及相關凋亡蛋白的表達水平，分析其作用機制，為開發抗腫瘤天然藥物提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人NSCLC A549細胞株購自中山大學附屬腫瘤醫院細胞培養物中心。大黃酸和四甲基偶氮唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司，Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒和DMEM培養基胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自菲博生物科技有限公司，兔抗人半胱氨酸蛋白酶3(cysteine protease-3, Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶9(cysteine protease-9, Caspase-9)、細胞色素C(cytochrome C, Cyt-C)和凋亡誘導因子(apoptosis induced factor, AIF)抗體購自美國Bio-Rad公司。凝膠成像儀和電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養細胞生長培養條件：置于含10%FBS的DMEM培養基，37℃、5% CO2培養箱中進行孵育，0.5%胰酶消化液消化傳代，每3 d 1次，實驗均采用對數生長期細胞。

1.3 MTT 法檢測A549細胞增殖能力取對數生長期的A549細胞以每孔4×103個接種于96孔板中，于37℃、5% CO2條件下孵育24 h，貼壁后，棄去培養液，實驗設對照組和低、中及高劑量大黃酸組，每個濃度設6孔。低、中和高劑量大黃酸組分別加入5、10和20 μmol· L-1大黃酸；對照組加入0.1% DMSO培養液。分別培養24、48和72 h后，棄去培養液，于各孔加入20 μL MTT溶液(5 mg· L-1)繼續培養4 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO，置于搖床室溫避光振蕩10 min，采用酶標儀檢測530 nm處各孔吸光度(A)值，以細胞增殖率表示細胞增殖能力。細胞增殖率=實驗孔A值/對照孔A值×100%。

1.4 流式細胞術FITC-Annexin Ⅴ/PI 雙染色法檢測細胞凋亡率采用低、中和高劑量(5、10和20 μmol· L-1)大黃酸處理A549細胞24 h后，按FITC-Annexin Ⅴ/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入100 μL細胞懸液、5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI混勻，室溫避光孵育30 min。加入5 μL PI(10 mg· L-1)，在黑暗中再次孵育10 min。上流式細胞儀采用Cell Quest軟件測定各組細胞凋亡率。

1.5 流式細胞術分析細胞周期取對數生長期A549細胞，稀釋至1×106L-1，接種于6孔板，每孔1 mL，隨機分為對照組和低、中及高劑量大黃酸組(5、10和20 μmol· L-1)，每組3次平行試驗。細胞經大黃酸處理24 h后，對照組和大黃酸組均經胰蛋白酶消化，PBS緩沖液沖洗，重懸在2 mL 70%乙醇中，4℃固定過夜。PBS緩沖液固定細胞，然后加入500 μL含37 mmol· L-1EDTA和0.1% Triton X-100的PBS緩沖液，最后加入100 μL PI (400 mg· L-1)，4℃避光保存，采用流式細胞儀分析不同細胞周期A549細胞百分比。

1.6 Western blotting法檢測各組A549細胞中Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C和AIF蛋白表達水平低、中和高劑量大黃酸組A549細胞分別采用5、10和20 μmol· L-1大黃酸處理48 h，收集 A549細胞，采用RIPA細胞裂解液裂解30 min，超聲破碎、離心分離后取上清液，Bradford法進行總蛋白質定量，上樣量為40 μg，120 V電泳分離蛋白，PVDF膜上轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶1 000稀釋)37℃孵育2 h，ECL法顯影，采用Image J軟件分析條帶積分光密度，以β-actin作為內參，行半定量分析，計算蛋白表達水平。蛋白表達水平=蛋白積分光密度/β-actin積分光密度。

1.7 單層細胞劃痕實驗檢測A549細胞遷移距離在6孔板中加入對數生長期的A549細胞(每孔約3×105個細胞)，37℃孵育過夜后用移液槍頭垂直劃痕。PBS緩沖液沖洗細胞去除劃下的細胞，低、中和高劑量大黃酸組分別加入5、10和20 μmol· L-1大黃酸的無血清培養基，對照組加入不含藥物的無血清培養基，在37℃、5% CO2培養箱培養，于0和24 h時拍照，每孔3個平行拍照，觀察0和24 h劃痕寬度，計算細胞遷移距離。細胞遷移距離(μm)=0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度。以細胞遷移距離表示細胞遷移能力。

1.8 Transwell實驗檢測A549細胞侵襲數量取對數生長期A549細胞，以血清培養基洗滌，調整細胞密度至1×105mL-1，取細胞懸液200 μL加入Transwell上室，低、中和高劑量大黃酸組分別加入5、10和20 μmol· L-1大黃酸，對照組加入不含藥物的細胞混懸液，每組3復孔。Transwell下室加入含FBS的完全培養基。培養24 h，上室內腫瘤細胞向下室聚集。24 h后，取出培養板，用棉簽擦去上室內的細胞，下室細胞以甲醇固定，0.1%結晶紫染色，沖洗封片后，顯微鏡下隨機取5個視野觀察侵襲細胞數量。

2 結 果

2.1 各組A549細胞增殖率與對照組比較，低、中和高劑量大黃酸組處理24、48及72 h后A549細胞增殖率均明顯降低(P<0.05)；與低劑量大黃酸組比較，中和高劑量大黃酸組A549細胞增殖率均明顯降低(P<0.05)；與中劑量大黃酸組比較，高劑量大黃酸組細胞增殖率明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點A549細胞增殖率

GroupProliferation rate of A549 cells(t/h) 2448 72 Control 0.96±0.141.08±0.151.33±0.23Rhein Low dose0.78±0.12?#0.96±0.11?#1.06±0.21?# Medium dose0.67±0.07?△0.76±0.04?△0.85±0.08?△ High dose0.56±0.05?△#0.56±0.07?△#0.62±0.02?△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with low dose of rhein group;#P<0.05 compared with medium dose of rhein group.

2.2 各組A549細胞凋亡率處理24 h后，與對照組比較，低劑量大黃酸組細胞凋亡率升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，中和高劑量大黃酸組細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)。見圖1和圖2。

2.3 各組不同細胞周期A549細胞百分比處理24 h后，與對照組比較，高劑量大黃酸組G1期A549細胞百分比明顯減少(P<0.05)，G2期A549細胞百分比明顯升高(P<0.05)。見圖3和圖4。

A:Control group; B-D:Low, medium and high doses of rhein groups.

2.4 各組A549細胞中Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C和AIF蛋白表達水平處理48 h后，與對照組比較，中和高劑量大黃酸組A549細胞中Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C和AIF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖5和圖6。

2.5 各組A549細胞遷移距離和侵襲細胞數量處理24 h后，與對照組比較，低、中和高劑量大黃酸組細胞遷移距離明顯減少，侵襲細胞數量明顯降低。見圖7和圖8(插頁四)。

A:Control group; B-D:Low,medium and high doses of rhein groups..

A:Control group; B-D:Low,medium and high doses of rhein groups..

3 討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中NSCLC是最常見的肺癌類型[17]。促進癌細胞凋亡是肺癌治療的常用手段之一，細胞凋亡主要分為3種途徑：死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網途徑。線粒體介導的凋亡相關因子主要包括Caspase、Cyt-C和AIF等[18]。Caspase家族通過破壞DNA、誘導細胞形成凋亡小體等方式，在細胞凋亡中發揮重要作用，主要包括Caspase-1、Caspase-3和Caspase-9。Caspase-3參與細胞凋亡起始，在細胞凋亡中發揮關鍵的作用，主要通過水解PARP，使受PARP負調控的因子升高，破壞核小體間DNA，從而引起細胞凋亡[19]。Cyt-C是線粒體受凋亡刺激后釋放到細胞質的可溶性蛋白，是線粒體途徑誘導細胞凋亡的關鍵因素，通過Caspase依賴途徑來誘導細胞凋亡[20-21]。Cyt-C在胞漿內與凋亡酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)結合，形成復合物，從而暴露出Caspase-9的結合位點，再聚合成三者的復合物，即“凋亡體”。而活化后的Caspase-9引起Caspase級聯反應，再激活下游的Caspase-3， Caspase-3繼而引起核小體間DNA裂解，最終導致細胞凋亡[22]。AIF屬于細胞線粒體細胞膜間隙的黃素蛋白，為誘發細胞凋亡因子。線粒體在受到凋亡刺激后，膜通透性增加，AIF被釋放到胞漿，再定向轉移至細胞核，促使DNA裂解[23-25]。研究[26]發現：Caspase通路與AIF既互相獨立，又多水平交叉，Caspase通路可誘發AIF釋放，同時AIF的釋放又可促進Cyt-C的釋放。

A:Control group; B-D:Low, medium and high doses of rhein groups.

圖4 各組不同細胞周期A549細胞百分比

Fig.4 Percentages of A549 cells at different cell cycles in various groups

Line 1: Control group; Line 2-4: Low, medium and high doses of rhein groups.

圖5 Western blotting 法檢測各組A549細胞中Caspase-3, Caspase-9, Cyt-C 和AIF蛋白表達電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of Caspase-3, Caspase-9, Cyt-C and AIF proteins in A549 cells in various groups detected by Western blotting method

A: Control group; B-D: Low, medium and high doses of rhein groups.*P<0.05 compared with control group.

圖6 各組A549細胞中Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C和AIF蛋白表達水平

Fig.6 Expression levels of Caspase-3, Caspase-9, Cyt-C and AIF proteins in A549 cells in various groups

近年來，天然產物的抗腫瘤活性為研究者所關注，其中凋亡誘導和增殖活性抑制是其治療癌癥的研究熱點[27-28]。這些天然產物通過促進NSCLC細胞凋亡，有效地抑制惡性腫瘤的生長且不良反應少。大黃酸是中藥大黃中的主要活性成分之一，已被證實對各種惡性腫瘤細胞具有較好的誘導凋亡和抗增殖的作用[29-30]，但目前有關大黃酸對肺癌細胞的影響及機制的研究較少。本研究結果顯示：與對照組比較，低、中和高劑量大黃酸組處理24、48和72 h 后A549細胞增殖率明顯下降，呈時間和劑量依賴性。中和高劑量大黃酸組A549細胞凋亡率明顯升高，說明不同劑量大黃酸均能抑制A549細胞增殖，誘導細胞凋亡，使細胞周期阻滯在G2期，并具有明顯的時間和劑量依賴性。本研究中Western blotting法檢測結果表明：A549細胞經 大黃酸處理48 h后，與對照組比較，低、中和高劑量大黃酸組A549細胞中Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C及AIF蛋白表達水平均明顯升高，說明大黃酸的抗腫瘤作用可能是通過調控蛋白表達途徑誘導細胞凋亡。劃痕實驗和Transwell實驗檢測結果表明：大黃酸處理24 h后，A549細胞的遷移和侵襲能力均受到明顯抑制。

綜上所述，大黃酸可通過調控細胞凋亡相關蛋白的表達有效抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲，本研究結果為臨床新藥開發提供了理論依據。

A, E: Control group; B,F: Low dose of rhein group; C,G:Medium dose of rhein group; D,H: High dose of rhein group;A-D:0 h; E-H:24 h.

圖7 劃痕實驗檢測各組A549細胞遷移能力

Fig.7 Migration abilities of A549 cells in various groups detected by scratch test