轉染TRIM29-siRNA對膠質瘤U87MG細胞周期和凋亡的影響

肖 華,姚聲濤

(遵義醫科大學附屬醫院腦血管病科,貴州 遵義 563099)

三結構域蛋白(tripartite motif，TRIM)家族是一類成員超過70種的大家族，具有典型的鋅指結構域、卷曲螺旋結構域和B-box結構域，在細胞生長、信號傳導和固有免疫等過程中發揮著重要作用，與膠質瘤的發生發展密切相關[1-3]。研究[4-6]顯示：TRIM家族成員三結構域蛋白29 (tripartite motif containing 29，TRIM29) 在鼻咽癌、骨肉瘤和結腸癌等腫瘤中異常高表達，且可通過調控細胞增殖、周期、侵襲、遷移和凋亡等在腫瘤的發生發展過程中發揮著類似原癌基因的作用。研究[7]顯示：TRIM29在膠質瘤中亦高表達，與患者病理分級密切相關，且抑制其表達可抑制腫瘤細胞增殖和遷移；然而，TRIM29在膠質瘤細胞周期和凋亡中的作用及調控機制并不清楚。本研究觀察干擾TRIM29表達對膠質瘤U87MG細胞周期和凋亡的影響，旨在進一步闡明TRIM29在膠質瘤發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人膠質瘤細胞系U87MG(中科院上海細胞庫)，兔抗人TRIM29、GAPDH抗體和鼠抗人CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2抗體(美國Santa Cruz公司)，辣根過氧化酶標記的二抗(美國Thermo Scientific公司)，RIPA裂解液(上海碧云天公司)，細胞周期試劑盒(美國BD公司)，碘化丙啶、胎牛血清、RPMI培養基、胰蛋白酶和青-鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)，BSA蛋白定量檢測試劑盒(美國Bio-Rad公司)，PVDF膜和ECL檢測試劑盒(美國Millipore公司)，熒光定量PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)，Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡試劑盒(南京建成生物公司)，TRIzol試劑和脂質體2000(美國Invitrogen公司)。CO2細胞培養箱(日本SONYO公司)，ChemiDoc XRS System成像儀(美國Bio-Rad公司)，FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞培養、分組和轉染將解凍復蘇后的U87MG細胞接種至含10%胎牛血清和100 U·mL-1青-鏈霉素雙抗的RPMI培養基上，并于37℃、5%CO2和飽和濕度的細胞培養箱內常規培養。實驗分為對照組(未轉染)、NC-siRNA組(轉染陰性對照NC-siRNA)和TRIM29-siRNA組(轉染TRIM29-siRNA)，每組設置3個復孔。將對數生長期的U87MG細胞以每孔1×106個接種至6孔細胞培養板上，細胞培養箱內常規培養。待細胞生長至約75%融合時，參照脂質體2000說明書將NC-siRNA或TRIM29-siRNA根據實驗分組轉至U87MG細胞中。轉染5 h后更新培養液繼續培養，48 h后胰蛋白酶消化收集各組細胞進行后續實驗。TRIM29干擾序列由上海吉瑪生物公司合成，TRIM29-siRNA序列為5′-CCGG-ACCTGAGCCGTAACTTCATTGCTCGAGCAA-TGAAGTTACGGCTCAGGTTTTTG-3′，陰性對照NC-siRNA序列為5′-CCGGGAACTCGAGTTCACATGGTTCCTCGAGGAACCATGTGAAC-TCGAGTTCTTTTTG-3′。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中TRIM29 mRNA表達水平采用TRIzol法提取對照組、NC-siRNA組和TRIM29-siRNA組細胞的總RNA后，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄合成單鏈cDNA，再以cDNA為模板，參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組細胞中TRIM29 mRNA的表達水平。PCR引物序列：TRIM29 上游引物，5′-TGCGAGCTGCATCTCAAGC-3′，TRIM29下游引物，5′-GGTGCTATGATTCTTGTGCTCC-3′;GAPDH 上游引物，5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，GAPDH 下游引物，5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。

1.4 Western blotting法檢測各組細胞中TRIM29、CyclinD1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表達水平向收集到的各組U87MG細胞中加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白后，參照BSA蛋白定量檢測試劑盒說明書檢測總蛋白的濃度。將熱變性的蛋白樣品上樣到SDS-PAGE凝膠中行電泳分離。分離結束后轉至PVDF膜。以5%脫脂奶粉封膜2 h后，加入稀釋1 000倍的TRIM29 一抗工作液于4℃下孵育過夜。次日，再以稀釋5 000倍的二抗工作液室溫孵育2 h。根據ECL檢測試劑盒說明書暗室內顯影曝光后，采用凝膠成像分析儀檢測，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.5 流式細胞術檢測各組細胞的細胞周期以磷酸緩沖液將收集到的TRIM29-siRNA組、NC-siRNA組和對照組細胞洗滌3次后，于4℃加入預冷的70%乙醇固定細胞24 h。胰酶消化收集各組細胞后，調整細胞濃度為1×105mL-1。取細胞懸液200 μL，根據細胞周期試劑盒說明書采用流式細胞儀檢測各組細胞的周期分布情況。實驗重復3次。

1.6 Annexin Ⅴ-FITC法檢測各組細胞凋亡率以磷酸緩沖液洗滌各組細胞后，制成濃度為1×104mL-1的細胞懸液，取細胞懸液200 μL，根據Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次。細胞凋亡率=(早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞)/細胞總數×100%。

2 結 果

2.1 各組U87MG細胞中TRIM29 mRNA和蛋白表達水平實時熒光定量PCR法檢測結果顯示：對照組、NC-siRNA組和TRIM29-siRNA組細胞中TRIM29 mRNA表達水平比較差異有統計學意義(F=311.31，P<0.05)；與對照組比較，NC-siRNA組U87MG細胞中TRIM29 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和NC-siRNA組比較，TRIM29-siRNA組U87MG細胞中TRIM29 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。Western blotting法檢測結果顯示：各組細胞中TRIM29蛋白表達水平比較差異有統計學意義(F=404.74，P<0.05)；與對照組比較，NC-siRNA組U87MG細胞中TRIM29 蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和NC-siRNA組比較，TRIM29-siRNA組U87MG細胞中TRIM29 蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖1和表1。

Lane 1:Control group; Lane 2:NC-siRNA group; Lane 3:TRIM29-siRNA group.

圖1 Western blotting法檢測各組U87MG細胞中TRIM29蛋白表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of TRIM29 protein in U87MG cells in various groups detected by Western blotting method

表1 各組U87MG細胞中TRIM29 mRNA和蛋白表達水平

GroupTRIM29 mRNATRIM29 proteinControl1.00±0.110.73±0.06NC-siRNA0.95±0.060.77±0.05TRIM29-siRNA0.23±0.02?△0.19±0.03?△

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with NC-siRNA group.

2.2 各組U87MG細胞中CyclinD1和P21蛋白表達水平Western blotting法檢測結果顯示：各組細胞中CyclinD1和P21蛋白表達水平比較差異有統計學意義(F=196.59，P<0.05；F=267.62，P<0.05)。與對照組比較，NC-siRNA組U87MG細胞中CyclinD1和P21蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和NC-siRNA組比較，TRIM29-siRNA組U87MG細胞中P21蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而CyclinD1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖2和表2。

Lane 1:Control group; Lane 2:NC-siRNA group; Lane 3:TRIM29-siRNA group.

圖2 Western blotting法檢測各組U87MG細胞中CyclinD1和P21蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of CyclinD1 and P21 proteins in U87MG cells in various groups detected by Western blotting method

表2 各組U87MG細胞中CyclinD1和P21蛋白表達水平

GroupCyclinD1 proteinP21 proteinControl0.69±0.050.21±0.03NC-siRNA0.72±0.070.26±0.03TRIM29-siRNA0.28±0.03?△0.55±0.04?△

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with NC-siRNA group.

2.3 各組U87MG細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達水平Western blotting檢測結果顯示：3組細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較差異有統計學意義(F=208.48，P<0.05；F=345.27，P<0.05)。與對照組比較，NC-siRNA組U87MG細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和NC-siRNA組比較，TRIM29-siRNA組U87MG細胞中Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖3和表3。

Lane 1:Control group; Lane 2:NC-siRNA group; Lane 3:TRIM29-siRNA group.

圖3 Western blotting法檢測各組U87細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in U87MG cells in various groups detected by Western blotting method

表3 各組細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平

GroupBcl-2BaxControl0.67±0.040.18±0.02NC-siRNA0.70±0.060.20±0.03TRIM29-siRNA0.31±0.03?△0.48±0.03?△

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with NC-siRNA group.

2.4 各組不同細胞周期U87MG細胞百分率流式細胞術檢測結果顯示：各組G0/G1期、S期和G2/M期U87MG細胞百分率比較差異有統計學意義(F=29.12，P<0.05；F=16.10，P<0.05；F=9.60，P<0.05)。與對照組比較，NC-siRNA組G0/G1期、S期和G2/M期U87MG細胞百分率差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和NC-siRNA組比較，TRIM29-siRNA組G0/G1期U87MG細胞百分比明顯升高(P<0.05)，而S期和G2/M期U87MG細胞百分率明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組不同細胞周期U87MG細胞百分率

GroupPercentage of U87MG cellsG0/G1SG2/MControl48.38±3.2527.86±3.2223.64±3.03NC-siRNA47.65±3.1628.48±3.3523.85±2.72TRIM29-siRNA59.26±4.32?△21.36±2.12?△19.38±1.15?△

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with NC-siRNA group.

2.5 各組U87MG細胞凋亡率流式細胞術檢測結果顯示：3組細胞凋亡率比較差異有統計學意義(F=187.88，P<0.05)。與對照組(6.12%±1.03%)比較，NC-siRNA組U87MG細胞凋亡率(7.54%±1.25%)差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組和NC-siRNA組比較，TRIM29-siRNA組U87MG細胞凋亡率(19.85%±2.36%)明顯升高(P<0.05)。見圖4。

3 討 論

膠質瘤是一種常見的惡性原發性腦腫瘤，盡管近幾十年來傳統療法如外科手術技術與設備、新化療藥物開發和放射外科治療等得到了快速發展，但尋找新的分子靶點和開發新的靶點療法以實現患者的長期生存仍然很重要[8-11]。

A:Control group;B:NC-siRNA group;C:TRIM29-siRNA group.

TRIM29屬于TRIM家族成員，位于人類染色體11q23上，可編碼588個氨基酸，被證實在膠質瘤組織和細胞中異常高表達，而干擾其表達可通過調控AKT信號通路抑制腫瘤細胞增殖[7]。細胞周期紊亂是細胞過度增殖促進膠質瘤惡性進展的重要機制[12-14]。TAN等[15]利用siRNA靶向抑制TRIM29表達通過調控PKC-NF-κB信號通路引起周期相關蛋白CyclinD1和CyclinE表達下降，導致細胞阻滯于G0/G1期，進而抑制膀胱癌5637細胞生長速率。HUANG等[16]研究顯示：敲低TRIM29表達誘導胃癌細胞阻滯于G0/G1期的機制與上調細胞周期密切相關蛋白P53和P21的表達有關。本研究轉染TRIM29-siRNA成功下調TRIM29表達后，G0/G1期膠質瘤U87MG細胞百分率和P21蛋白表達水平明顯升高，而CyclinD1蛋白表達水平明顯降低。這表明TRIM29沉默可通過調控CyclinD1和P21蛋白的表達誘導膠質瘤細胞周期阻滯于G0/G1期。提示TRIM29在膠質瘤細胞周期調控中發揮著重要作用。

細胞凋亡是一種正常的生理性死亡過程，與細胞增殖相似，其發生異常與膠質瘤發生發展有密切關聯[17-20]。聶宇等[21]研究發現：靶向沉默TRIM29可誘導骨肉瘤細胞凋亡。XU等[22]對甲狀腺癌的研究發現：敲低TRIM29表達可通過增強促凋亡相關基因Bax、caspase-3和caspase-9活性，降低抑凋亡基因Bcl-2活性，誘導細胞凋亡，以增強順鉑的化學敏感性。本研究轉染TRIM29-siRNA可使膠質瘤U87MG細胞凋亡率明顯升高；此外，轉染TRIM29-siRNA亦引起膠質瘤U87MG細胞中Bax表達升高和Bcl-2表達降低。本研究結果表明：TRIM29沉默可促進膠質瘤U87MG細胞發生凋亡，提示TRIM29可通過調控Bax和Bcl-2的表達在膠質瘤細胞凋亡過程中發揮著重要的調控作用，沉默其表達可誘導膠質瘤U87MG細胞凋亡。

綜上所述，轉染TRIM29-siRNA可誘導U87MG細胞周期阻滯和凋亡，其作用機制可能與下調CyclinD1、Bcl-2蛋白表達和上調P21、Bax蛋白表達有關。本研究結果進一步豐富了TRIM29調控膠質瘤發生發展的分子機制，但TRIM29是通過何種信號途徑發揮調控作用的還需后續深入研究。