孕期及哺乳期鉛暴露對仔代大鼠學習記憶能力的影響及其機制

李 環，尹曉婷，錢鴻昊，張 晶

(北華大學醫學院環境衛生教研室，吉林 吉林 132001)

鉛是環境中存在的重金屬污染物，對兒童和動物中樞神經系統(central nervous system,CNS)的發育具有極大的毒性。學習和記憶認知障礙是鉛中毒兒童的主要臨床癥狀。鉛暴露通過影響突觸功能可塑性，即長時程增強(long-term potentiation,LTP)或長期抑制(long-term depression,LTD)[1]，從而影響動物的學習記憶能力。有關海馬相關的空間學習和記憶過程研究[2]顯示：即刻早基因c-fos及其產物在學習記憶的信號傳導中起重要作用，c-fos蛋白是促進神經結構重塑并刺激神經生長的重要因素。另外海馬相關神經遞質如興奮性神經遞質谷氨酸(glutamic acid，Glu)、抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)等含量可直接反映學習記憶能力[3]。小清蛋白(parvalbumin, PV)主要在籃狀和樹枝狀GAGA神經元中表達，精神分裂癥患者的認知功能損害與PV陽性GAGA神經元的突觸抑制功能障礙密切相關[4]，在患者海馬和杏仁核等腦區PV陽性的GAGA神經元密度下降[5]，據此推測PV也會影響學習記憶能力。但PV對子代學習記憶能力的作用尚未見報道。本研究對孕期及哺乳期母鼠通過自由飲水接觸不同水平鉛，建立鉛暴露模型，通過檢測出生10 d后仔代大鼠學習記憶能力、血液中鉛質量濃度、海馬組織中鉛和一氧化氮(nitric oxide， NO)水平及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性及c-fos和PV蛋白的表達情況，探討c-fos及PV與仔代大鼠學習能力、海馬組織中NO水平及NOS活性的相關性，闡明鉛對仔代大鼠神經系統發育期記憶功能損害的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器8只雌性和4只 Wistar大鼠購自吉林大學實驗動物中心,動物許可證號：SCXK(吉)2010-0005，體質量為250～270 g，將大鼠飼養在12 h∶12 h的明暗循環中，通風良好且溫度恒定(18℃～23℃)，相對濕度45%～55%，動物適應實驗室的光照和喂養條件，1周后用于實驗。所有實驗方案均遵循《實驗動物的護理和使用指南》中的原則和程序進行，并經北華大學實驗動物使用倫理委員會批準。 醋酸鉛(分析純，沈陽化學試劑有限公司)，考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、NO硝酸還原酶法試劑盒和NOS化學比色法試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗大鼠c-fos抗體和PV單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，HRP-抗兔二抗(武漢博士德公司)，BCA 試劑盒 (上海碧云天生物技術有限公司)。AI1200原子吸收光譜儀(加拿大Aurora公司)， Bio Imaging System凝膠成像系統(美國Gene公司)，AY120電子分析天平(日本島津公司)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司),LDZ4-0.8臺式離心機(北京醫用離心機廠)，Morris水迷宮(中國醫學科學院)，24UV型超純水儀(美國Millipore公司)

1.2 實驗動物模型制備和分組Wistar大鼠適應1周后，將8只雌性大鼠單獨飼養，并隨機分為對照組和低、中及高劑量鉛暴露組，每組2只。低、中和高劑量鉛暴露組大鼠分別飲用含0.05%、0.10%和0.20%醋酸鉛的去離子水，對照組大鼠飲用去離子水。2周后以雌雄比例2∶1合籠，每日早6點檢查雌鼠陰栓，當確定雌鼠懷孕后，對孕鼠繼續飲用含鉛的去離子水直至仔鼠出生后第10天。每組隨機選取10只仔代大鼠用于后續實驗，雌雄不限。

1.3 仔代大鼠Morris水迷宮實驗按照田元春等[6]報道的水迷宮方法進行仔代大鼠定位航行實驗和空間探索。該實驗過程包括訓練5 d和測試1 d。訓練當天，將大鼠依次按北西南東4個象限入水點放入池中，測定120 s內找到水下平臺的時間(即逃避潛伏期)和游泳路徑的長度，找到平臺實驗便終止。將在120 s內找不到平臺的大鼠引導到平臺上，并停留30 s。未能找到平臺大鼠的逃避潛伏期按 120 s 計算。最后 1 d 進行空間探索實驗，撤去平臺，于訓練時的對側入水點把仔代大鼠放入水中自由游泳2 min，檢測其尋找原平臺所在象限的穿越次數和停留時間。為減少外界環境對仔代大鼠的干擾，訓練及測試期間迷宮外參照物及環境保持不變,實驗人員盡量保持安靜，測試時間為每天上午 9:00-12:00。

1.4 仔代大鼠血液和海馬組織中鉛質量濃度測定水迷宮實驗后，仔鼠眼球取血，將血收集到裝有肝素鈉的離心管中，頸椎脫臼處死，冰上剝離腦組織，取雙側大腦半球，分離海馬組織，稱質量。將全血及左側海馬組織用硝酸進行消化并定容，采用原子吸收分光光度法通過AI1200原子吸收光譜儀測定鉛質量濃度。

1.5 生化方法檢測仔代大鼠海馬組織中NO水平和NOS活性準確稱量右側海馬組織，放入離心管中，在冰上按質量體積比為1∶9加入生理鹽水，置于組織勻漿機中進行勻漿后，低溫離心，2 500 r·min-1離心 10 min，提取上清液于-20℃保存，待測。按照NO及NOS測定試劑盒采用生化方法進行測定分析。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測仔代大鼠海馬組織中c-fos和PV蛋白表達水平將每組仔代大鼠的海馬組織取出并迅速置于-80℃保存待測。將樣品置于4℃預冷裂解緩沖液(質量體積比為1∶6)中，4℃超聲粉碎(6 s×3次)，4℃孵育30 min，每10 min震蕩1次，低溫離心12 000 r·min-1，10 min×3次，取上清液分裝并于-80℃保存。通過Bradford法測定蛋白質含量，使用標準牛血清白蛋白通過10% SDS-PAGE分離蛋白質。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入1∶100兔抗大鼠c-fos抗體和PV單克隆抗體，在37℃搖動1 h，用PBST洗滌3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)，在37℃搖動1 h，用PBST洗滌3次，然后用化學發光劑在凝膠成像系統觀察條帶。使用Image J軟件通過灰度值測定法對蛋白質進行定量，以c-fos和PV蛋白與相應內參(β-actin)灰度值的比值代表c-fos和PV蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組仔代大鼠學習記憶能力與對照組比較，中和高劑量鉛暴露組仔代大鼠逃避潛伏期和游泳距離明顯增加(P<0.05)；目標象限停留時間和穿越次數明顯減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表1。

2.2 各組仔代大鼠血液和海馬組織中鉛質量濃度經單因素方差分析，各組仔代大鼠血液和海馬組織中鉛質量濃度比較差異有統計學意義(F=176.44，P<0.01；F=37.37，P<0.01)；與對照組比較，鉛暴露組仔代大鼠血液和海馬組織中鉛質量濃度明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表2。

2.3 各組仔代大鼠海馬組織中NO水平和NOS活性各組仔代大鼠海馬組織中NO水平和NOS 活性比較差異有統計學意義(F=4.105，P<0.05；F=3.443，P<0.05)；與對照組比較，高劑量鉛暴露組仔代大鼠海馬組織中NO水平明顯降低(P<0.05)，NOS活性降低(P<0.05)。見表3。

表1 各組仔代大鼠空間學習記憶能力

GroupPositioning navigation testEscape latency(t/s)Swimming distance (l/m)Space exploration experimentTime of staying in target quadrant (t/s) Number of cossingplatform (n)Control9.41±4.3113.59±2.2117.75±2.336.27±1.01Lead-exposed Low dose10.65±3.1714.54±3.5112.84±3.574.40±1.72 Medium dose 17.31±2.81?18.62±2.71?9.32±1.28?3.52±0.96? High dose24.13±4.91?21.35±2.45?7.66±2.02?1.95±0.48?F6.2853.9244.4097.045P0.0040.0240.0160.002

*P<0.05 compared with control group.

表2 各組仔代大鼠血液和海馬組織中鉛質量濃度

Tab.2 Lead concentrations in blood and hippocampus tissue of offspring rats in various groups

Group Concentration of lead Blood Hippocampus tissueControl5.45±0.110.34±0.03Lead-exposed Low dose98.42±18.23?1.15±0.19? Medium dose 203.35±23.45?1.45±0.17 High dose358.78±85.18?1.69±0.13?F176.4437.37P<0.01<0.01

*P<0.05 compared with control group.

2.4 各組仔代大鼠海馬組織中c-fos和PV蛋白表達水平隨著母鼠暴露鉛劑量的增加仔代大鼠海馬組織中c-fos蛋白表達水平逐漸降低，而PV蛋白表達水平逐漸升高。與對照組比較，中和高劑量鉛暴露組仔代大鼠海馬組織中PV蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而各劑量暴露鉛組仔代大鼠海馬組織中c-fos蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖1。

表3 各組仔代大鼠海馬組織中NO水平和NOS活性

Group NO level[mB/(μmol·g-1)]NOS[λB/(U·mg-1)]Control7.07±1.223.29±0.62Lead-exposed Low dose6.64±1.133.25±0.53 Medium dose 6.25±0.862.95±0.51 High dose5.15±0.68?2.35±0.63?F4.1053.443P0.0200.036

*P<0.05 compared with control group.

2.5 仔代大鼠海馬組織中c-fos和PV蛋白表達水平與學習記憶能力相關指標相關性經Pearson相關分析，仔代大鼠海馬組織中c-fos蛋白表達水平與空間探索實驗中仔代大鼠目標象限停留時間和穿越次數以及海馬組織中NO水平和NOS活性呈正相關關系(P<0.01)；仔代大鼠海馬組織中PV蛋白表達水平與空間探索中仔代大鼠目標象限停留時間和穿越次數以及海馬組織中NO水平和NOS活性呈負相關關系(P<0.01)。見表4。

3 討 論

神經系統是鉛的主要靶標，由于人類的大腦發育以及人類妊娠期與大鼠妊娠期及產后10 d相對應[7]，本文作者建立了人類等效妊娠期鉛暴露大鼠模型以探討鉛對海馬相關空間學習和記憶能力的影響。本研究結果顯示：隨醋酸鉛暴露劑量增加，仔代大鼠血液和海馬組織中鉛質量濃度升高，證實在孕期和哺乳期接觸鉛，鉛就能被子代所吸收并進入仔鼠腦內發生蓄積[8-9]。有研究[10-11]顯示：Cx43半通道參與了鉛從細胞外到細胞內的轉運，但發育中的大腦血腦屏障并不完善，且生長發育期鉛暴露可損害大鼠血腦屏障緊密連接，使鉛蓄積于腦組織。

海馬是一種邊緣結構，與學習和記憶功能密切相關。Morris水迷宮實驗是檢測生長發育期海馬損害較為敏感的檢測方法[12]。本研究結果顯示：母鼠孕期和哺乳期接觸鉛，可使仔代大鼠在Morris水迷宮任務中存在缺陷，表現為平均逃避潛伏期和游泳距離明顯延長，穿越隱匿平臺次數明顯減少，說明仔代大鼠學習和記憶功能已經表現為損傷。

*P<0.05 compared with control group.

Lane 1:Control group;Lane 2-4:Low,medium and high doses of lead-exposed groups.

圖1 各組仔代大鼠海馬組織中c-fos和PV蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.1 Electrophoregram(A)and histogram(B) of expressions of c-fos and PV proteins in hippocampus tissue of offspring rats in various groups

表4 仔代大鼠海馬組織中c-fos和PV蛋白表達水平與學習能力相關指標的相關性分析

Tab.4 Correlation analysis on expression levels of c-fos and PV proteins in hippocampus tissue and learning and memory abilities of offspring rats

Learning abilityc-fosrPPVrPEscape latency-0.6160.0010.2820.181Swimming distance-0.5720.0040.3490.095Time of staying in target quadrant0.6310.001-0.4920.036Number of crossing platform 0.729<0.01-0.3930.057NO content 0.5860.004-0.3620.083NOS activity 0.4720.020-0.2850.177

學習記憶能力的分子基礎是LTP，研究[13]顯示：神經元內典型的NO作為逆行性信息分子，通過NO-cGMP 信號系統,參與了LTP，而NOS 是催化生成NO的關鍵酶[14]。REDDY等[15]研究發現：低劑量鉛暴露可降低大鼠神經元細胞中 NOS 活性，抑制 NO產生，降低其調節 LTP 的能力，產生認知障礙。其原因為鉛作為金屬離子可與 NOS 活性中心結合或者通過離子的競爭拮抗作用抑制 Ca2+的內流，從而降低 NOS 活性或使 NOS失活，減少NO 的產生，鉛可以通過氧化損傷機制激活誘導型NOS，生成 ONOO-自由基，破壞神經元細胞的抗氧化系統，促使與學習記憶相關的基因、蛋白質等結構和功能發生變化，使學習記憶功能下降[16-18]。本研究結果顯示：母鼠鉛暴露后，仔代大鼠海馬組織中NO水平及NOS活性較對照組均明顯降低，并且隨母鼠鉛暴露劑量的增加，NO水平下降也更加明顯，這也加重了鉛的神經發育毒性進而影響學習記憶能力，此結果也與上述的水迷宮測試結果相符合，隨著仔代大鼠海馬組織中鉛質量濃度的升高，NOS活性明顯下降，產生的NO水平不足以完成LTP，影響學習能力。

c-fos存在于海馬組織中[19]。目前c-fos與學習記憶關系的研究最為深入。c-fos基因缺乏小鼠的空間學習記憶能力明顯降低[20],有學者[21]提出將 c-fos 基因作為學習記憶功能的客觀指標之一。研究[22]顯示：大鼠急性鉛暴露時出現的學習記憶功能的受損可能與鉛通過Ca2+/CaM-CaMKⅡ信號轉導通路抑制CaMKⅡ下游因子CREB和c-fos蛋白的活性有關。本研究結果顯示：母鼠鉛暴露后仔代大鼠海馬組織中c-fos蛋白表達水平下降；并且相關分析結果顯示c-fos蛋白表達水平與水迷宮測試的學習能力指標以及海馬組織中NO水平呈正相關關系，因此推測鉛可能通過影響與c-fos相關的信號通路和關鍵分子而產生神經毒效應，影響學習記憶能力。

PV作為鈣結合蛋白(calcium-binding proteins, CBPs)家族成員，主要通過對細胞內 Ca2+濃度的調控平衡神經元膜內外Ca2+濃度。研究[23-24]顯示：PV能夠通過對抗缺血缺氧性腦損傷引起的胞內Ca2+超載從而起到神經保護作用，且PV是腦內抑制性系統的主要神經化學物質，PV蛋白表達于中樞神經系統GABA能中間神經元的亞群中，參與突觸的形成及其功能的成熟并具有神經保護作用。研究[25]證實：鉛可以使海馬神經細胞中Ca2+濃度升高，超載的 Ca2+導致海馬神經元損傷及神經功能損害，突觸傳遞效能減弱，從而引起大鼠學習記憶能力下降。本實驗中鉛暴露組仔代大鼠海馬組織中PV蛋白表達水平高于對照組，并在相關分析中顯示PV蛋白表達水平與水迷宮測試的學習能力指標以及海馬組織中NO水平呈負相關關系，提示海馬組織中PV蛋白與學習記憶功能有一定關系。本文作者推測升高的PV蛋白表達水平可能一方面能緩沖細胞內游離Ca2+，減輕Ca2+超載損傷；另一方面通過對PV中間神經元的突觸活化作用增強，使得該區域的神經元相對抑制而保護神經，是機體的一種反饋調節機制。但PV蛋白的高表達可能也會導致動物腦內興奮性和抑制性平衡發生改變，因而使得本研究中高劑量鉛暴露組仔代大鼠的神經行為改變明顯突出。鉛暴露后PV蛋白在海馬組織中高表達的效應是機體的反饋保護機制還是鉛的損傷機制所引起尚需進一步深入探討。

綜上所述，大鼠孕期及哺乳期鉛暴露可損傷仔代大鼠的學習記憶能力，其毒性作用機制可能與海馬組織中c-fos蛋白表達水平降低和PV蛋白表達水平升高有關。