乙型肝炎病毒對不同ALT狀態下慢性乙型肝炎患者T淋巴細胞及其亞群的影響

高 鵬，雒艷萍，李俊峰

(1.蘭州大學第一醫院傳染病研究室，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學基礎醫學院免疫教研室，甘肅 蘭州 730030)

乙型病毒性肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的以肝臟病變為主的一種傳染病，其嚴重影響著人類的生命健康[1-2]。目前，全球有3.5～4.0億人感染HBV，抗病毒治療改善患者生活質量是全球醫學界奮斗的重要任務[3]。以T淋巴細胞介導的細胞免疫反應紊亂是乙肝發病過程中的重要環節。有研究[4-5]顯示：機體感染HBV后，常可出現T淋巴細胞及其亞群的紊亂，常表現為CD4+T淋巴細胞下降，CD8+T淋巴細胞升高，Th1/Th2淋巴細胞比例失衡。這種變化常造成細胞免疫功能不足，機體免疫功能下降，直接導致病毒清除困難，疾病遷延不愈。但有關HBV病毒載量高低與T淋巴細胞及其亞群關系的文獻報道較少，特別是在不同丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminetransferase， ALT)水平狀態下兩者之間的關系目前研究甚少。ALT大于等于正常上限2倍增高，是臨床抗病毒治療乙肝的適應證之一。同時也根據ALT正常與否，將乙肝感染者分為HBV攜帶者和乙肝患者。研究[3]顯示：HBV在不同ALT水平狀態下，對機體的影響不同。但目前以ALT分組探討不同ALT狀態下HBV對T淋巴細胞及其亞群影響的文獻報道少見。本研究探討HBV在不同ALT狀態下對T淋巴細胞及其亞群的影響，旨在闡明以ALT分組抗病毒治療的免疫學機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月—2017年12月在蘭州大學第一醫院門診和住院確診為慢性乙肝的患者363例，其中男性280例，女性83例，年齡18～60歲。所選患者病例完整，經臨床和實驗數據分析后，其中ALT正常組慢性乙肝患者131例(ALT<40 U·L-1)，ALT大于等于正常上限且小于2倍增高組慢性乙肝患者110例(40 U·L-1≤ALT<80 U·L-1)，ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者122例(ALT≥80 U·L-1)。并且按HBV載量分為低復制組(HBV DNA<4.0 lg copies·mL-1)、中復制組(4.0 lg copies·mL-1≤HBV DNA<6.0 lg copies·mL-1)和高復制組(HBV DNA≥6.0 lg copies·mL-1)。觀察各組患者不同載量的HBV對T淋巴細胞總數、Th/i細胞數、Ts/c細胞數以及血清中白細胞介素2(interleukin-2,IL-2)、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)和白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)水平的影響。同時對ALT大于等于正常上限2倍增高的慢性乙肝患者給予恩替卡韋(0.5 mg·d-1)治療，隨訪24周，觀察抗病毒治療前后患者機體病毒學及免疫功能的改變。慢性乙肝的診斷標準符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》[6]的診斷標準。同時排除妊娠期婦女、中度和重度脂肪肝患者、酒精性肝病患者、藥物性肝損傷患者、自身免疫性肝損傷患者、曾經接受過抗病毒治療的患者和并發其他肝炎感染的患者，以及并發其他心血管和腎臟等重大臟器病變患者。

1.2 主要儀器

熒光定量PCR分析儀購自德國 Lightcycler ROCH公司，流式細胞儀(FACS Calibur)和配套試劑購自美國BD公司，AU400型全自動生化分析儀購自日本Olympus公司，XE2100型全自動血細胞計數儀購自日本Sysmex公司。

1.3 方 法

1.3.1 乙肝兩對半定量檢測 采集患者靜脈血并分離血清，按羅氏 Cobas e 601 化學發光免疫分析儀的操作步驟進行定標及樣本檢測。

1.3.2 乙肝病毒DNA檢測 采集患者靜脈血并分離血清，按HBV DNA 定量檢測試劑盒和基因擴增儀操作步驟進行檢測，敏感度 >500 copies·mL-1。

1.3.3 外周血細胞分類計數 無菌操作采集靜脈血 2～3 mL，EDTA-K2 抗凝，XE2100型全自動五分類血細胞分析儀進行淋巴細胞計數檢測。

1.3.4 CD3、CD4和CD8 單抗標記的制備 取100 μL EDTA-K2 抗凝血加入20 μL 三色單克隆抗體(抗 CD3 PE-CY5/抗 CD4-FITC/抗 CD8-PE)，陰性對照取 100 μL EDTA-K2 抗凝血加入20 μL鼠抗人 IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE，混勻，室溫放置20 min。 加入Muti-Q-Prep 溶血劑處理，每份標本均做測定管和陰性對照管。

1.3.5 T淋巴細胞分類檢測 流式細胞儀(FACS Calibur)開機預熱30 min 后，用 Flow-check 熒光微球進行光路流路校正，將HPCV 調節在 2% 以內前向和側向散射信號采用線性放大，熒光信號采用對數放大，檢測淋巴細胞表面CD3、CD4和CD8表達，其陽性表達以百分率(%)表示。

1.3.6 血清細胞因子檢測 采集患者靜脈血并分離血清，按IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10檢測試劑盒的操作步驟進行ELISA法檢測，檢測患者血清中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 ALT正常組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標

在ALT正常組，不同HBV載量患者 T 淋巴細胞總數，Th/i淋巴細胞數，Ts/c淋巴細胞數，血清IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 ALT正常組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標

GroupnT lymphocyte(CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+ CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+ CD8+)(η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)IL-4[ρB/(ng·L-1)IL-10[ρB/(ng·L-1)Low replication4364.28±12.5744.95±8.9521.25±6.7238.29±21.2610.02±3.0143.25±21.5216.27±6.24Middle replication4663.25±11.2745.19±9.2520.62±6.5837.51±19.669.98±3.1244.82±20.4715.58±6.08High replication4262.98±13.5443.68±10.02 19.75±6.2139.64±22.5111.21±3.2740.81±18.9515.23±5.89F0.195 20.264 61.658 30.593 10.726 80.681 70.954 0P0.736 30.623 50.193 70.563 00.325 30.483 90.246 0

2.2 ALT大于等于正常上限且小于2倍增高組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標

在ALT大于等于正常上限且小于2倍增高組，隨著HBV載量的增高患者血清IL-2和IFN-γ水平升高(P<0.05)，而其他指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 ALT大于等于正常上限2倍增高組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標

在ALT大于等于正常上限2倍增高組，隨著HBV載量的增加，T 淋巴細胞總數和Th/i淋巴細胞數明顯下降(P<0.05)，Ts/c淋巴細胞數明顯升高(P<0.05)；在Th細胞亞群方面，隨著HBV載量的增加反映Th1細胞的細胞因子IL-2和IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)，而反映Th2細胞的細胞因子IL-4和IL-10水平明顯下降(P<0.05)。見表3。

表2 ALT大于等于正常上限且小于2倍增高組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標

GroupnT lymphocyte (CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+ CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+ CD8+)(η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Low replication3858.76±12.8540.22±8.1630.28±5.9641.65±20.2115.87±10.5243.28±17.6517.63±6.91Middle replication3557.93±12.1741.16±8.3531.08±5.8952.46±21.2319.86±11.08844.21±18.9616.51±7.27High replication3758.23±13.3440.46±8.7931.19±5.7157.38±24.5623.93±12.5741.87±18.0616.38±7.08F0.525 40.468 80.312 111.221 710.653 50.319 40.413 6P0.610 00.716 10.736 6<0.01<0.010.735 00.758 2

表3 ALT大于等于正常上限2倍增高組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標

GroupnT lymphocyte (CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+CD8+) (η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Low replication3956.19±13.0538.41±6.7934.62±6.8060.57±26.5428.07±14.4738.46±20.5114.15±7.03Middle replication4153.42±11.2335.63±6.2836.92±6.5277.52±30.5135.52±22.5435.06±19.1311.15±7.26High replication4250.01±10.0832.63±6.0838.89±7.0685.84±32.5443.52±26.8132.08±18.339.13±6.54F 11.025 210.354 411.251 69.541 713.582 415.526 48.574 9P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

2.4 ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者恩替卡韋抗病毒治療前后病毒學和血清學指標

對于ALT大于等于正常上限2倍增高組122例慢性乙肝患者采用恩替卡韋抗病毒治療(0.5 mg·d-1)，治療前后病毒學和血清學指標變化進行配對t檢驗。與治療前比較，治療后患者HBV DNA、HBsAg和HBeAg明顯降低(P<0.05)；HBV DNA完全應答率為72.95%，部分應答率為89.34%，HBeAg血清學轉換率為17.07%，有1例患者發生HBsAg陰轉，陰轉率為0.82%。見表4。

表4 ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者恩替卡韋抗病毒治療前后病毒學和血清學指標

“-”:No data.

2.5 ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者恩替卡韋抗病毒治療前后免疫學指標

對于ALT大于等于正常上限2倍增高的122例慢性乙肝患者采用恩替卡韋抗病毒治療(0.5 mg·d-1)，治療前后免疫學指標變化進行配對t檢驗。與治療前比較，治療后患者T 淋巴細胞總數和Th/i淋巴細胞數明顯升高(P<0.05)，Ts/c淋巴細胞明顯下降(P<0.05)。在Th細胞亞群方面，與治療前比較，患者血清中反映Th1細胞的細胞因子IL-2和IFN-γ水平明顯下降(P<0.05)，反映Th2細胞的細胞因子IL-4和IL-10水平明顯升高(P<0.05)。見表5。

表5 ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者恩替卡韋抗病毒治療前后免疫學指標

GroupHBV DNA(lg copies·mL-1)T lymphocyte (CD3+)(η/%)Th/i(CD3+CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+CD8+) (η/%)Before treatment6.46±1.9753.35±12.6536.59±6.7936.17±6.12After treatment3.62±1.2061.29±11.6643.46±8.3921.78±7.56t12.305 516.032 117.195 911.531 0P<0.01<0.01<0.01<0.01GroupIL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Before treatment78.69±30.2835.07±14.4736.11±20.2512.39±7.01After treatment38.31±20.2410.15±4.7544.80±20.1116.32±6.77t18.542 317.974 415.235 113.710 7P<0.01<0.01<0.01<0.01

3 討 論

HBV感染人體后，可處于不同的免疫狀況，臨床上根據癥狀、體征和肝功能指標，特別是ALT是否正常將其分為HBV攜帶者和乙肝患者，HBV攜帶者多數無明顯癥狀體征，肝功能輕度受損， ALT多為正常或輕度增高[7-8]。而乙肝患者大多出現黃疸、厭食和乏力等癥狀和體征。肝功能嚴重受損，其中ALT多出現2倍以上增高[9]。同時ALT大于等于正常上限2倍增高是臨床抗病毒治療乙肝的適應證之一。這得到了廣大肝病界專家的共識，而且也被寫進乙肝治療指南中。相關文獻[10-11]報道：HBV感染人體后，其發生發展與機體的免疫功能，特別是以T淋巴細胞為主的細胞免疫功能有密切聯系。但是目前很少有文獻以ALT為節點，探討不同ALT狀態下HBV對T淋巴細胞及其亞群的影響。

本研究結果顯示：在ALT正常組，不同載量的HBV對T淋巴細胞及其亞群的影響無明顯差別，這是因為在此階段，多為HBV攜帶者[12]，機體多數處于免疫耐受狀態，HBV在機體內與機體免疫系統達成平衡狀態，不管載量的高低，均未引起強烈的免疫反應，故病毒載量與機體的免疫細胞數量無明顯相關性[13-14]。當然也有可能在此階段，機體的免疫系統未充分識別出乙型肝炎病毒，不論載量高低，機體均未對其做出強烈的免疫應答，未能引出強烈的細胞免疫應答和體液免疫應答，因此在此階段病毒載量與免疫效應細胞數量上無相關性[15]。因此對此階段的HBV感染者，臨床上多以密切觀察為主，而不采用抗病毒治療。

而在ALT異常組，特別是ALT大于等于正常上限2倍組中，隨著病毒載量的增加T淋巴細胞總數和CD4+T淋巴細胞數明顯下降，CD4+T淋巴細胞是機體抗病毒的主要細胞，CD4+細胞通過分泌細胞因子，以促進特異性B細胞和細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)成熟和增殖，具有較強的抗病毒效應[16-17]。而在T淋巴細胞亞群方面，隨著病毒載量的升高，反映Th1細胞的細胞因子IL-2和IFN-γ水平明顯升高。反映Th2細胞的細胞因子IL-4和IL-10水平明顯下降。Th1細胞的誘導分化與病毒清除有關,并同時與肝組織的病理損傷有關，Th2細胞的誘導分化能抑制Thl細胞的分化,導致HBV感染的慢性化,又有利于防止Th1細胞應答過度而造成的病理損傷[18-19]。正常機體Th1/Th2處于相對平衡，互相協調，互相制約，而在免疫應答階段這種平衡被打破，機體免疫功能處于紊亂狀態[20-21]，在本研究中表現為隨著病毒載量的增高，Th1/Th2的平衡被打破，機體免疫功能處于紊亂狀態。在此階段，乙肝患者多出現黃疸、厭食和乏力等癥狀及體征。病程遷延不愈，大多與機體的免疫功能失常有關。對乙肝患者，臨床上多積極抗病毒治療。

本研究探討了恩替卡韋抗病毒治療24周前后患者病毒指標及免疫功能指標的變化，恩替卡韋是核苷酸類似物，具有強效的抗病毒治療效果，經抗病毒治療24周后，患者HBV DNA明顯清除，機體獲得了抗病毒治療應答，HBeAg明顯陰轉，T淋巴細胞總數和CD4+T淋巴細胞數明顯上升，IL-2和IFN-γ水平明顯下降，IL-4和IL-10水平明顯升高，Th1/Th2的平衡恢復正常。表明抗病毒治療可以有效地改善患者的免疫功能，HBV載量下降，可以減緩機體的病理性免疫反應，減少對機體的損傷。

綜上所述，不同的ALT狀態下，HBV載量高低對機體免疫功能有不同的影響，并且對于ALT大于等于正常上限2倍增高的乙肝患者積極進行抗病毒治療可以明顯改善機體的免疫狀態。因此區分判斷這一點，有助于臨床對病毒免疫機制的認識，并采用適當的方式抗病毒治療。