M1型巨噬細胞相關(guān)因子在重度慢性牙周炎患者牙齦組織中的表達及其意義

蔡如佳，關(guān) 寧，劉乙臻，高秀秋，王琳源

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點實驗室，遼寧 錦州 121000)

慢性牙周炎是一種由牙周菌斑微生物引發(fā)的炎癥性、破壞性疾病，是我國成年人牙齒缺失的主要原因[1]，也是心血管疾病、糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的重要危險因素[2]。目前臨床上治療慢性牙周炎主要采用牙周基礎(chǔ)治療和手術(shù)治療，但因其病情長期存在，有部分患者經(jīng)治療后牙周組織仍然存在炎癥，要取得根治的效果相對困難。因此，研究慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制，尋找有力的治療手段是目前亟需解決的問題。近年來研究[3-4]顯示：牙周炎的進展及嚴重程度與宿主自身免疫性炎癥反應(yīng)存在密切關(guān)聯(lián)。當致病菌開始入侵牙周組織時，先天性免疫系統(tǒng)發(fā)揮宿主防御功能。牙周組織的先天免疫系統(tǒng)包括軟組織屏障和免疫細胞。巨噬細胞作為宿主先天免疫的重要組成部分[5]，能夠分泌單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)等趨化因子，從而誘導(dǎo)更多的巨噬細胞在牙周組織中活化聚集，通過趨化因子產(chǎn)生和自我調(diào)節(jié)，建立防御機制。巨噬細胞還可以通過膜上的識別受體，識別微生物表面的病原相關(guān)分子，從而有效地吞噬病原微生物，進而在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要功能，維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)[6]。其中，M1型巨噬細胞作為巨噬細胞的一種亞型，具有黏附和殺傷細菌、分泌大量促炎因子及啟動獲得性免疫應(yīng)答的作用[7]。但在重度慢性牙周炎的病損組織中M1型巨噬細胞的表現(xiàn)及其在發(fā)病過程中可能發(fā)揮的功能目前國內(nèi)少見相關(guān)文獻報道。本實驗通過檢測M1型巨噬細胞相關(guān)因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)和信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducers and activators of transcription 1，STAT1)在重度慢性牙周炎病損組織中的表達情況，探討M1型巨噬細胞在重度慢性牙周炎中的作用，旨在為牙周炎的防治提供免疫理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑蛋白Marker(賽默飛公司，美國)，Anti-iNOS Antibody ab204017(Abcam公司，英國)，STAT1 Antibody(Cell Signaling公司，美國)，β-actin Antibody和Rabbit Anti-beta-Actin (Loading Control)(Bioss公司，中國)、PVDF膜(GE公司，美國)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和麗春紅染色液(碧云天公司，中國)，HiScriptR Ⅱ One Step RT-PCR Kit(Vazyme公司，中國)，100 bp DNA Ladder Marker(大連TaKaRa公司，中國)，TRIzol(Ambion公司，中國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、iNOS和STAT1引物合成及DEPC水(北京鼎國昌盛生物科技有限公司，中國)。

1.2 樣本采集和處理選擇2017年12月—2018年5月就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科和口腔頜面外科的患者，收集15例重度慢性牙周炎患者的病損牙齦組織作為實驗組，收集15例埋伏阻生需要拔除的患牙，取阻生牙冠方覆蓋的健康牙齦組織作為健康對照組。所有入選的研究對象均滿足研究要求的納入和排出標準。本研究通過錦州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會審查，所有研究對象均知情同意。實驗組納入標準參照文獻[8]：探診出血(bleeding on probing，BOP)陽性，牙周探診深度(probing depth，PD)≥6 mm，附著喪失(attachment loss， AL)≥5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收超過根長的1/2，甚至達到根長的2/3，后牙存在Ⅱ或Ⅲ度根分叉病變，需要≥2顆患牙具有以上特征；如僅有2顆患牙符合，則必須為不相鄰患牙且位于不同象限。對照組納入標準參照文獻[9]：PD<3 mm，無AL，無牙槽骨吸收，BOP陰性，經(jīng)臨床和影像學(xué)(曲面斷層)檢查確診為阻生智齒，且無明顯的臨床炎癥，無盲袋形成。排除標準：①所有納入對象均滿足無全身系統(tǒng)性疾病；②吸煙或有吸煙史；③不滿18歲；④有全身性疾病，如糖尿病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；⑤妊娠或哺乳期；⑥6個月內(nèi)進行牙周治療或使用抗生素及漱口水等；⑦長期抗炎治療，使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等。

1.3 RT-PCR法檢測2組患者牙齦組織中iNOS和STAT1 mRNA表達水平①TRIzol法提取牙齦組織中的mRNA。先用PBS液清洗組織，后加入1 mL TRIzol試劑，用小剪刀盡量剪碎(在冰上操作)，用槍頭反復(fù)吹打后室溫放置5 min，然后加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置2～3 min，高速離心，4℃、12 000 r·min-1，離心15 min，吸取上層無色水相至新的EP管中(注意切勿吸到中層物質(zhì))，加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻后室溫放置5 min，高速離心，4℃、12 000 r·min-1，離心10 min，盡量吸凈上清液，保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇，震蕩數(shù)次后，高速離心，4℃、12 000 r·min-1，離心5 min，盡量吸凈乙醇保留沉淀，室溫干燥2～5 min后加入30 μL DEPC水進行溶解，將EP管放到60℃水浴鍋孵育5 min。②RNA濃度測定。取1 μL RNA樣本，加入99 μL DEPC水，紫外分光光度計測量RNA濃度。③RT-PCR 反應(yīng)。按照一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒配置25 μL 反應(yīng)體系，加入反應(yīng)體系中RNA的量約為300 ng。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行PCR擴增。引物設(shè)計：iNOS上游引物序列 5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3′，下游引物序列 5′-GGCTGTCAGAGTCTTGTGCCTTTGG-3′，擴增目的基因片段長度為497 bp；STAT1上游引物序列 5′-AAGCAAGCGTAATCTTCAG-3′，下游引物序列 5′-GGTCTCGTGTTCTCTGTT-3′，擴增目的基因片段長度為298 bp；以β-actin為內(nèi)參照，β-actin上游引物序列 5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物序列 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，擴增目的基因片段長度為285 bp。引物均由北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為94℃、5 min；35個PCR循環(huán)(94℃、30 s，58℃、45 s，72℃、1 min)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠分離，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)掃描后測量條帶強度，以目標條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示iNOS和STAT1 mRNA表達水平。

1.4 Western blotting法檢測2組患者牙齦組織中iNOS和STAT1 蛋白表達水平取出適量標本，室溫融化，加入150 μL裂解液，反復(fù)吹打以充分裂解細胞，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)蛋白定量后按照每孔20 μg上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠(10%SDS-PAGE)電泳并經(jīng)濕式轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉后，取一抗稀釋液(TBST液)按照1∶1 000稀釋iNOS和STAT1抗體，4℃搖床過夜；洗膜后，再加入按照1∶10 000稀釋的二抗，室溫振搖孵育2 h，充分洗膜后，用ECL法顯色、曝光后測量X光膠片上條帶灰度值，以β-actin進行標定，以目標條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示iNOS和STAT1蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 2組患者牙齦組織中iNOS和STAT1 mRNA表達水平在對照組健康牙齦組織和實驗組重度慢性牙周炎牙齦組織中，iNOS和STAT1均有不同程度的表達，且在實驗組重度慢性牙周炎患者牙齦組織中iNOS和STAT1 mRNA表達水平明顯高于對照組(P<0.01)。見圖1和表1。

Lane 1: Control group;Lane 2: Experimental group.

圖1 2組患者牙齦組織中iNOS和STAT1 mRNA表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of iNOS and STAT1 mRNA in gingiva tissue of patients in two groups

表1 2組患者牙齦組織中iNOS和STAT1 mRNA表達水平

GroupiNOSmRNASTAT1 mRNAContr ol0.290±0.5000.300±0.041Experimental0.970±0.145?1.020±0.117?

*P<0.01vscontrol group.

2.2 2組患者牙齦組織中iNOS和STAT1蛋白表達水平在對照組健康牙齦組織和實驗組重度慢性牙周炎牙齦組織中iNOS和STAT1蛋白均有不同程度的表達；實驗組患者牙齦組織中iNOS和STAT1 蛋白表達水平高于對照組(P<0.01)。見圖2和表2 。

Lane 1: Control group;Lane 2: Experimental group.

Fig.2 Electrophoregram of expressions of iNOS and STAT1 protein in gingiva tissue of patients in two groups

表2 2組患者牙齦組織中iNOS和STAT1蛋白表達水平

GroupiNOS proteinSTAT1 proteinControl0.160±0.6250.260±0.121Experimental0.890±0.084?0.860±0.198?

*P<0.01vscontrol group.

3 討 論

慢性牙周炎是一種發(fā)生在牙齒支持組織的免疫炎癥性疾病，可引起牙周支持組織(牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì))的破壞和吸收。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)作為牙周炎的主要致病菌，其侵襲牙周組織后能激活大量的炎癥細胞[10]。JAGANNATHAN等[11]在慢性牙周炎患者的齦溝液中檢測到大量的巨噬細胞浸潤。有研究[12]顯示:在重度牙周炎的病損組織中巨噬細胞大量聚集，破壞牙周組織基底膜層，使脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等內(nèi)毒素進入牙齦組織，吸收入血后，持續(xù)刺激患者全身免疫反應(yīng)，使患者體內(nèi)炎癥水平顯著增高，表明巨噬細胞與牙周炎病變組織中的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

巨噬細胞在外界不同的刺激下，可以發(fā)生不同方向的極化進而分化為具有不同表型和功能的巨噬細胞[13]。單核細胞在炎癥因子的刺激下，通過STAT1途徑，誘導(dǎo)生成經(jīng)典的 M1 型巨噬細胞。M1型巨噬細胞表現(xiàn)出較強的促炎性，大量表達 IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α)和iNOS等，能激活機體免疫應(yīng)答，加重炎癥反應(yīng)和組織損傷[14]。在IL-4和IL-10等刺激下，巨噬細胞分化為替代性活化的M2型巨噬細胞，進而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)的作用[15]。GEMMELL等[16]研究發(fā)現(xiàn)：與正常健康的牙齦組織比較，慢性牙周炎患者牙齦組織中CD80陽性的M1型巨噬細胞浸潤明顯增加，并伴隨B細胞和T細胞明顯增加，表明M1型巨噬細胞能顯著影響慢性牙周炎的發(fā)病過程。

牙齦卟啉單胞菌中的LPS與血清來源的LPS結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)結(jié)合后，激活Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)，是誘導(dǎo)M1型巨噬細胞形成的重要原因。激活的M1型巨噬細胞通過接頭蛋白髓樣分化因子(myeloid differentiation protein，MyD88)依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活核因子κB(nucler factor-κB,NF-κB)途徑[17]，最終巨噬細胞通過無氧糖酵解途徑釋放大量iNOS。iNOS在機體中能夠調(diào)節(jié)血管張力和微血管的通透性，誘導(dǎo)炎性細胞遷移并激發(fā)其氧化活性，進而起到抑制和殺滅病原微生物的作用[18]。iNOS不存在于非激活的巨噬細胞中，在LPS和IFN-γ誘導(dǎo)激活的M1型巨噬細胞中，可穩(wěn)定測出iNOS活性以及mRNA和蛋白表達[19]。因此iNOS被認為是M1型巨噬細胞活化狀態(tài)的標志物。

STAT1是一種能夠與目的基因啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在非受體型酪氨酸蛋白激酶(Janus kinase，JAK)的作用下，被磷酸化并發(fā)生二聚化，游離出來轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達。STAT1主要參與調(diào)控病毒、細菌以及寄生蟲感染的免疫激活、細胞分化和抑制細胞生長等生理過程。研究[20-21]顯示：IFN-γ能夠通過激活JAK-STAT1信號通路調(diào)控巨噬細胞極化。IFN-γ主要通過激活STAT1,增強巨噬細胞對病原菌的殺傷能力與抗原呈遞能力，并加速一系列促炎細胞因子的分泌[22]。IFN-γ能誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化，STAT1成為M1型巨噬細胞表型調(diào)節(jié)因素的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。所以本文作者通過檢測慢性牙周炎患者牙齦組織中M1型巨噬細胞相關(guān)因子STAT1 mRNA和蛋白表達水平，從而評價重度慢性牙周炎患者牙齦組織中巨噬細胞狀態(tài)。

綜上所述，在健康牙齦組織和重度慢性牙周炎牙齦組織中均存在M1型巨噬細胞標志物iNOS和相關(guān)因子STAT1的表達，并且重度慢性牙周炎組牙齦組織中iNOS和STAT1 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于健康牙齦組織，表明在重度慢性牙周炎中M1型巨噬細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答增強，M1型巨噬細胞參與牙周組織的炎癥反應(yīng)和組織損傷，為以iNOS和STAT1作為標志物評估慢性牙周炎的炎癥進程提供借鑒。由于本研究受樣本量以及檢測方法限制，其相關(guān)M1型巨噬細胞在重度慢性牙周炎中的具體作用機制還需要大樣本觀察和實驗進一步論證。