國產冷凍設備（靶向刀）消融活體豬肝的實驗研究

王輔明，李 娜，羅 榮，韋廣旭，楊繼金

冷凍消融作為一種局部消融治療手段目前已經被廣泛應用于全身實體腫瘤的治療。治療早期腎癌、前列腺癌和小肝癌的效果被認為與外科手術切除治療效果相當[1-3]。最新的臨床隨機對照研究表明，在治療小于3 cm的肝癌冷凍消融和RFA治療效果相當，在長徑3～4 cm的肝癌冷凍消融治療效果優于RFA，在聯合TACE、放射性粒子、免疫治療等其他治療手段治療大肝癌可以明顯延長患者生存期[4-7]。冷凍消融的治療效果與包括溫度、低溫持續時間、降溫及復溫速率等消融參數密切相關。目前針對肝、肺腫瘤的冷凍消融，臨床上普遍使用的是由Littrup等[8]在2009年基于氬氦冷凍系統提出的先冷循環10 min，然后復溫5 min，重復2次的冷凍消融方案。目前新型的冷凍設備靶向刀（Accu Target），采用了氬氣和氮氣混合氣體作為冷媒，結合了氬氣降溫速率快，氮氣極點溫度低的特點，較氬氦刀具有更快的降溫速率，和更低的極點低溫[9]。

本研究以活體小型巴馬香豬為動物實驗模型，設計不同的消融方案使用國產冷凍設備（靶向刀）消融小型豬肝臟組織，消融過程中CT監測靶區的冰球形成，消融術畢取出靶區肝臟組織固定、石蠟包埋、切片、末端脫氧核苷核轉移酶-生物素dUTP切口末端標記法（TUNEL）染色及HE染色，探究1次冷-熱循環和2次冷-熱循環的消融范圍及實際壞死范圍的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 經長海實驗動物倫理委員會批準，共計4只巴馬香豬納入實驗研究。實驗用小型巴馬香豬由上海市奉賢區銀根實驗動物公司提供，體重范圍25～30 kg，雌雄不限，均具有健康檢疫合格證書。

1.1.2 實驗設備 本研究使用的冷凍設備選擇低溫冷凍系統（靶向刀型號AT-2008II，上海導向醫療），冷媒為高壓氮氣和氬氣（工作壓力1 300～1 500 ps），功率選擇100%。冷凍針直徑為1.5 mm，針尖帶有實時測溫功能，冷凍針工作區域長度為1.5 cm。CT設備為16排大孔徑螺旋CT（西門子公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗過程 小型巴馬香豬隨機分為A、B兩組，每組2只。實驗前禁食12 h，使用速眠新Ⅱ注射液合劑0.1 mL/kg和地西泮注射液5 mg的合劑于臀部肌內注射誘導小型豬全身麻醉，待動物完全麻醉后，于耳緣靜脈留置淺靜脈針固定牢靠，20 mL注射器手動緩慢推注丙泊酚維持麻醉，觀察動物的麻醉狀態及呼吸情況緩慢多次給藥，丙泊酚的起始用量為1 mL，術中遞增給藥。備硫酸阿托品注射液、尼可剎米、洛貝林等呼吸道急救藥品備用，實驗過程中當觀察到動物出現呼吸道黏液分泌過多、梗阻等癥狀，立即注射呼吸系統急救藥品改善緩解動物呼吸狀況，以保證實驗順利完成。固定小型豬仰臥位于定制的簡易手術臺，中上腹部備皮沿右側肋緣標記手術切口，消毒鋪單，切開皮膚，逐層分離皮下組織，徹底暴露出肝臟。

將小型豬固定于定制手術上后放置于CT掃描床上，預先掃描1次，設定好CT掃描的參數（90 kV，1 mm層厚，層距1 mm），每只豬肝臟分別選擇肝葉較厚實部分，切避開膽囊、大血管、主肝管作為目標消融區，每只豬肝臟選擇2個目標消融區。靶消融區間隔距離5 cm以上，放置冷凍針，使用自制的固定支架固定好冷凍針，CT掃描1次，確認冷凍針放置位置滿意后，開始冷凍消融。A組選擇冷凍消融方案為冷循環10 min，復溫3 min，循環1次。B組冷凍消融方案選擇冷循環10 min，復溫3 min，循環2次。每個靶區冷循環結束后掃描CT，計算多平面重建（MPR）橢球形低密度冰球影的最大寬徑（見圖 1）。

圖1 小型巴馬香豬冷循環術畢CT掃描及MPR重建圖像

1.2.2 標本處理 冷凍消融方案完成后，拔出冷凍針，沿冷凍針道插入大頭針做好標記。大劑量推注丙泊酚處死小型豬，結扎肝臟主要大血管，取出靶區的肝臟組織標本，于4%甲醛溶液中固定48 h，固定完成后，標本沿著冷凍針穿刺針道垂直方向，沿橢球形消融區域的最大寬經線處切開后石蠟包埋、切片、TUNEL染色和HE染色。

1.2.3 染色方法 HE染色主要用來觀察冷凍消融術后消融區域內病理學改變，TUNEL染色用以判讀消融區域內實際壞死的范圍，當細胞發生調亡或壞死時，細胞核基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶的催化下加上熒光素 （FITC） 標記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡下視野亮綠色染色為陽性壞死細胞。

1.3 統計學方法

所有統計分析均使用SPSS（版本22，美國紐約，IBM公司）統計學軟件。所有數據都表示為平均值±標準差,CT掃描顯示冰球覆蓋范圍的最大寬徑，以及TUNEL染色標記的實際壞死半徑，均使用配對t檢驗的統計學方法進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 比較兩種循環方案消融范圍的差異

本組研究共計8個靶消融區，其中A組1次（冷-熱10～3 min）循環方案的4個，B組2次循環（冷-熱 10～3 min）4個。其中1次循環冰球低密度影的寬徑為（27.6±0.9） mm，2次循環冰球低密度影的寬徑為（31.4±0.5） mm，2次循環的消融范圍較1次循環更大,差異有顯著統計學意義（P＜0.001）。

2.2 比較兩種循環方案消融范圍內實際壞死范圍

在熒光顯微鏡下觀察標本的TUNEL染色判讀消融區域內實際壞死范圍，在40×倍視野下，由穿刺點中央向外圍觀察針道周圍的綠色熒光染色陽性細胞比例，中央部分完全壞死區域陽性細胞均勻充滿視野，外圍非冷凍區域鮮有陽性細胞表達，視野向針道沿直線外移動時，觀察到出現陽性細胞比例急劇減少的區域，標記該點為消融區域實際壞死邊界（見圖2）。每個切片，沿針道穿刺點向外延伸，每隔90°的方向標記一個點，使用Toup View顯微鏡圖像測量軟件測量標記點距離針道的距離，取4組數據平均值作為該切片的實際壞死半徑。1次循環的冰球范圍內實際最大半徑為（8.4±0.2） mm，而2次循環的冰球范圍內實際最大壞死半徑為（12.6±0.4） mm。而1次循環冰球覆蓋范圍內實際壞死的邊界距低密度影覆蓋范圍的邊界距離為（5.6±0.5） mm，而2次循環冰球覆蓋范圍內實際壞死的邊界距低密度影覆蓋范圍的邊界距離為（3.2±0.2） mm（見表1）。

圖2 40×鏡下TUNEL染色

表1 兩種循環方案CT掃描低密度影與實際壞死范圍的關系 mm

3 討論

冷凍的治療效果受多種因素影響：冷凍速率、組織溫度、凍融時間、循環時間以及間隔周期等[10]。臨床也在不斷探索如何制定合理的冷凍消融方案。目前有很多動物實驗表明，延長冷循環時間或者增加循環次數可以造成冷凍區域更大的壞死范圍。已有研究認為肝、肺3次冷-熱循環的效果優于2次冷-熱循環，臨床研究認為瘤體直徑＜3 cm 的晚期非小細胞肺癌3 次冷-熱循環治療能獲得較好的近期局部療效，但是目前3次循環的冷凍消融方案并未在臨床上推廣使用[11-14]。“冷熱10～5 min”2次循環模式是基于早些年氬氦刀冷凍設備的基礎上提出來的，但是對于目前新型的冷凍消融設備（靶向刀），采用了氬氣和氮氣混合氣體作為冷媒，結合了氬氣降溫速率快，氮氣極點溫度低的特點，較傳統氬氦刀具有更快的降溫速率，和更低的極點低溫，冷循環開啟后可在60 s內靶區溫度降到-170 ℃，復溫采用電輔助加熱的方式，可在30 s內靶區溫度上升到50 ℃左右。本研究顯示2次循環的消融范圍明顯較1次循環更大，1次循環的消融范圍局限，且形成冰球范圍內的有效壞死范圍小，因此認為對于國產冷凍消融設備（靶向刀），2次循環的消融方案仍然很有必要。

早前的實驗研究比較超聲引導下觀察冰球范圍與實際壞死的差異，標記實際壞死的范圍使用“印度墨汁”，超聲顯示消融范圍與實際壞死范圍僅為1 mm左右的誤差。“印度墨汁”標記實際壞死范圍是基于碳粒廓清原理觀察微循環血管是否破壞而判斷壞死區域，這種方法判讀腫瘤細胞是否滅活似乎并不準確。目前臨床上評價冷凍消融效果更多的是病理學觀察，臨床上目前最常用判讀壞死的病理染色為HE染色，可以直觀準確、真實地反映實際組織消融范圍，Li等[13]在活體小豬肝臟冷凍術后HE染色觀察主要分為中央壞死區，炎癥區域，充血區，肉芽腫區以及凋亡區，在凋亡區域仍然存在正常的組織及細胞，其他4個病理表現區域則認為的實際壞死區域。在研究比較射頻、冷凍及不可逆電穿孔幾種消融方式邊緣區域比較的實驗中，有學者使用TUNEL染色作為判讀靶區內的實際壞死范圍，可以很好地標記靶區的無活性細胞，細胞在TUNEL上24 h后不能存活的過渡區的最內側可能代表腫瘤有效治療的保守邊界[15-16]。本研究同樣使用TUNEL染色法判讀實際壞死范圍，可以準確地判讀出冷凍消融術后實際壞死范圍。

圖3 TUNEL染色圖片

目前很多臨床研究認為局部腫瘤進展率與技術成功率有關，是否達到完全消融是局部腫瘤進展的主要決定因素[17-18]。從病理學層次上討論，局部腫瘤進展可能與腫瘤周圍5～10 mm范圍內的微血管浸潤及微衛星轉移灶有關，但是個體特異性差異較大。Okusaka等[19]報道在149例切除的孤立性小肝癌中，19%患者有外周有衛星病灶，33%位于原腫瘤周圍5 mm內，50%位于原腫瘤10 mm以內。在另外一項單純結節型肝癌的研究中，66.7%患者在腫瘤周圍2 mm處發現鄰近微衛星病灶，其余11.1%患者微衛星病灶位于腫瘤周圍5 mm內。為確保達到對病灶的完全消融，其他熱消融方式比如射頻、微波通常選擇的做法是保證靶區消融范圍足夠大，覆蓋腫瘤周圍正常肝組織即所謂的消融安全邊緣5～10 mm，以保證消融區域完整的覆蓋腫瘤。本實驗表明，當前使用的2次循環的消融方案，消融范圍與實際壞死區域的安全消融邊緣為（3.2±0.2）mm，認為對于國產冷凍設備（靶向刀）消融范圍至少要保證覆蓋病灶周圍正常肝臟組織3.5 mm以上，但是考慮可能存在的微衛星灶，條件允許的情況下冷凍范圍覆蓋正常肝臟組織最好在10 mm以上。

綜上表明，目前廣泛使用的2次冷-熱循環的方案對于國產冷凍設備（靶向刀）仍然很重要，在消融肝臟腫瘤過程中，至少要保證冰球要覆蓋病灶周圍正常肝臟組織3.5 mm以上才足夠。