酚酸類化感自毒物質對枸杞種子萌發的抑制作用

李 敏,閆興富,馬 麗,馬 璐,時 榕

1 北方民族大學生物科學與工程學院, 銀川 750021 2 北方民族大學國家民委生態系統模型及應用重點實驗室,銀川 750021

化感作用(Allelopathy)是生態系統中存在的普遍現象,指部分植物(也包括部分微生物)釋放某些化學物質至外部環境,從而對鄰近個體的生長發育產生影響[1]；此類化學物質被稱為化感物質,主要來源于高等植物次生代謝產物,其化學本質多為小分子有機化合物。如果化感物質的供體和受體是同一種植物,且對該植物的生長發育產生不利影響,則這種現象被稱為自毒作用(Autotoxicity),是化感作用的一種特殊形式[2- 3]。自毒作用往往在農業生產領域產生負面效應。

植物殘體分解、根系分泌以及雨露淋溶是自毒物質進入外部環境的主要途徑[4- 5]。農田長期耕種同一作物,容易導致同一類自毒物質在土壤介質中累積,尤其在作物根系附近土壤形成高濃度微環境[6- 7]。當自毒物質積累到一定量時,即可對植物產生毒害作用,作用機制較為復雜。以酚酸類自毒物質為例,研究發現該類物質可對植物細胞膜的通透性、酶的含量與活性、礦物質元素的吸收與利用、蛋白質和核酸的代謝、光合作用等生理活動產生負面影響[8-11]。此外,自毒物質與土壤理化性狀劣變、根際微生物種群劣變等也存在關聯[11- 15],被認為是導致農業生產連作障礙的重要誘因之一[16- 17]。

枸杞(LyciumbarbarumLinn.)為茄科植物,是落葉的多年生小灌木。目前,受道地性產區土地資源緊缺和農民種植習慣等因素制約,連作障礙日趨突出[18- 19],應給予足夠重視。然而,關于枸杞連作障礙成因的研究十分匱乏。已有研究證實以阿魏酸、香草酸和肉桂酸等為代表的酚酸類有機酸是番茄[13]、西瓜[20- 21]、苜蓿[22]、山桃[23]、楊樹[24- 25]等眾多作物的主要化感自毒物質,上述酚酸在枸杞植株體內含量較高[26- 27],阿魏酸是枸杞根際分泌物的主要成分[28]。隨著連作年限的增加,上述化合物在枸杞根際微環境中不斷累積,很可能成為枸杞連作障礙的潛在誘因。檢驗化感物質對待試植物種子萌發的影響,是化感物質活性研究的一種主要方法,因為種子萌發是植物生命周期中非常敏感和重要的一個階段,研究結果具有一定的代表性。定量構效關系(Quantitative structure-activity relationship, QSAR)研究方法利用化學、數學、計算機和生命科學等交叉學科技術,將化合物的生物活性與分子結構聯系起來,可一定程度揭示化合物分子與生物受體相互作用機制。因此,本文全面考察常見酚酸類物質對枸杞種子萌發過程的化感自毒作用,并利用3D-QSAR中比較分子場分析法(Comparative molecular field analysis, CoMFA),揭示該類化合物分子結構特征與其化感自毒活性之間的內在關系,為酚酸類物質對枸杞的化感自毒作用研究以及枸杞連作障礙成因的解析提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

高壓滅菌鍋、9 cm玻璃培養皿、9 cm圓形濾紙、錫箔紙、恒溫培養箱等。

枸杞果干(寧杞1號)、高純水(采用Milli-Q制備,電阻率大于18 MΩ·cm),酚酸類化合物(種類見表1)購自阿拉丁試劑(中國,上海),純度≥97%,10%次氯酸鈉溶液。

1.2 種子萌發培養及化感自毒活性測定

9 cm玻璃培養皿中墊入2層濾紙,高壓蒸汽滅菌(121 ℃、15 min)制備成濾紙床。將枸杞干果于高純水中浸泡過夜,輕輕碾碎果肉后取枸杞種子,于室溫下晾干。采用10%次氯酸鈉溶液浸泡枸杞種子消毒10 min,用無菌水反復漂洗數次后將種子移至濾紙床,每個濾紙床(培養皿)中放入10粒種子。在溫度為28±0.5 ℃的培養箱中遮光培養7 d,其中培養伊始于每個濾紙床中加入7 mL不同濃度酚酸溶液,第4天于每個培養皿中續加3 mL溶液。

對每一個酚酸化合物設置0(即7 mL無菌水,空白對照CK)、25、50、75、100、125、150 mg/L 7個濃度梯度。以單個濾紙床為1個平行計,每個酚酸濃度設置3個平行。

每天監測各個濾紙床中種子的萌發情況,7天后測定胚根長、胚軸長,并通過計算酚酸類化合物對種子萌發、胚根生長和胚軸生長的抑制作用(以抑制率定量計算),繪制濃度-抑制率計量效應曲線,求取半抑制濃度IC50,分別表示為IC50,萌發率、IC50,胚根長和IC50,胚軸長,定量評價酚酸對枸杞種子萌發過程的抑制效應；其中,抑制率(%)=(空白對照CK-處理)/空白對照CK×100%。

1.3 三維定量構效關系建模

圖1 22種酚酸類化合物分子疊合圖Fig.1 Overlay chart of the 22 phenolic acids

定量構效關系建模分析中,生物活性數值采用以摩爾濃度單位計的IC50(μmol/L)數值,具體見表1。3D-QSAR分析采用比較分子場分析方法,所有的操作均采用 SYBYL 7.0 軟件各模塊完成。酚酸類化合物分子結構優化使用 Tripos 力場,分子電荷采用Gasteiger-Huckel電荷,能量最小化計算過程中,Gradient閾值為0.005。采用生物活性最大(以摩爾濃度計IC50,胚根長最小)化合物2,3,4-三甲氧基肉桂酸為模板,使用 Align Database 方法將所有分子進行疊合。其疊合效果如圖1所示。將疊合好的分子置于默認的三維網格(2 ? grid)中,按照默認的探針(+1價sp3雜化C原子)、步長(1.0) 以及能量閾值(30 kcal/mol)進行CoMFA分析,未進一步說明的參數均采用 SYBYL 軟件默認設定值。統計學分析采用偏最小二乘(Partial Least Squares Analysis, PLS)方法建立模型,采用抽一法(Leave-One-Out, LOO)進行交叉驗證。

表1 酚酸類化合物對枸杞種子萌發的化感自毒作用實驗值與模型分析值

CAS No.: 美國化學文摘登記號,chemical abstracts service number

2 結果與分析

2.1 酚酸類化合物抑制枸杞種子萌發的劑量效應

22種酚酸類化合物對枸杞種子萌發的化感作用測定結果如表1所示,22種酚酸類化合物在較高濃度下均能抑制枸杞種子的萌發；分別采用抑制種子萌發、胚根生長和胚軸生長獲得的IC50數值范圍為78.88—115.97、56.47—81.72和39.94—80.56 mg/L；對比各IC50數值大小發現,IC50,胚根長和IC50,胚軸長數值比IC50,萌發率更低,表明采用抑制胚根、胚軸生長指標評價酚酸類物質的化感自毒活性更靈敏。統計學分析發現在0.05水平上IC50,胚根長和IC50,胚軸長呈顯著正相關,Pearson相關系數為0.498,IC50,萌發率與上述兩個指標無相關性。

本研究囊括的酚酸類化合物化學分子結構均包含苯環和活性羧基結構,具有較大的共性,但苯環上取代基類型和數量、取代位點等構成了酚酸類化合物結構的多樣性,實驗結果顯示各化合物對枸杞種子萌發的化感自毒活性表現出了極顯著差異(P<0.01),酚酸類化合物化感活性和結構之間的關系值得深入探討。

2.2 酚酸類化合物抑制枸杞種子萌發的定量構效關系

2.2.1CoMFA建模統計學分析

經多次嘗試,發現以IC50,胚根長(μmol/L)數據構建的CoMFA模型最優,其統計學參數見表2。交叉驗證相關系數Q2為0.802,表明獲得的模型具有較高的自身一致性；在95%置信度水平進行非交互驗證,得到模型的相關系數R2為0.938。立體場與靜電場的貢獻值分別為48%和52%,說明酚酸化合物分子結構立體場和靜電場對其化感自毒活性都有影響,其中靜電場作用稍強。

表2 CoMFA模型的偏最小二乘法分析結果

Q2：交叉驗證相關系數,cross-validated correlation coefficient；R2：非交互驗證相關系數,non-cross-validation analysis correlation coefficient；SEE：估算值標準誤差,standard error of estimate；F：費歇爾檢驗值,the Fisher test value；NC,最佳主成分數,the optimum number of components

2.2.2CoMFA三維等高圖分析

酚酸類化合物對枸杞種子萌發抑制作用的構效關系CoMFA三維等高圖如圖2所示。在立體場中,綠色表示增大基團體積會導致化感自毒活性增加,黃色表示增大基團體積會使化感自毒活性降低；在靜電場中,紅色表示增加帶負電基團會導致化感自毒活性增強,藍色表示增加帶正電基團會導致化感自毒活性增強。

圖2 CoMFA模型三維等高圖Fig.2 Contour maps of CoMFA model

在CoMFA模型的立體場中,苯環母核1、2、3和4號位上均覆蓋了大面積的綠色色塊,代表在上述4個取代基位點存在大體積取代基會增加酚酸類化合物的化感自毒活性。苯環1號位取代基構效關系如表3所示,比較苯甲酸與肉桂酸分子結構,發現兩者除1位取代基存在差異外其余分子結構均相同,前者1位取代基為羧基,后者為苯烯酸,二者的化感自毒活性隨1位取代基體積增大而呈增加的趨勢；4-羥基苯甲酸與對香豆酸、3,4-二羥基苯甲酸與咖啡酸、香草酸與阿魏酸、丁香酸與芥子酸,上述4組化合物分子結構特征與化感自毒活性大小也符合這一規律。苯環2號位取代基構效關系如表4所示,比較苯甲酸與水楊酸、肉桂酸與2-甲氧基肉桂酸、對香豆酸與2,4-二羥基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸與2,3-二甲氧基肉桂酸上述4組化合物,發現在其他分子結構一致的前提下,在苯環2號位上增加羥基或者甲氧基取代基團,取代位點處分子體積增大,相應化感自毒活性增強。苯環3號位取代基構效關系如表5所示,比較4-羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸與香草酸,三者分子結構除3號位點外其余結構特征均一致,在苯環3號位上增加羥基或甲氧基取代基團、或者甲氧基替換羥基取代基,導致3號位取代基體積增大,相應化感自毒活性呈增加趨勢；肉桂酸、3-羥基肉桂酸與3-甲氧基肉桂酸,香豆酸、咖啡酸與阿魏酸,2-甲氧基肉桂酸與2,3-二甲氧基肉桂酸,上述3組化合物苯環3號位取代基呈現出的構效關系也符合這一規律。苯環4號位取代基構效關系如表6所示,對比苯甲酸與對羥基苯甲酸等4組化合物,發現苯環4號位取代基體積大小與化感自毒活性構效關系規律與3號位取代基的一致。以上實驗結果與CoMFA模型立體場色塊圖指示的構效關系規律契合良好。

表3 酚酸類化合物1號位取代基構效關系

表4 酚酸類化合物2號位取代基構效關系

在CoMFA模型的靜電場中,苯環母核1號位置上覆蓋了紅色色塊,代表1號取代基存在電負性較大的基團,會導致化合物化感自毒活性增強。如表3所示,對比肉桂酸類衍生物和苯甲酸類衍生物,前者丙烯酸基團的電負性高于后者的羧基,前者的化感自毒活性也強于后者。上述實驗結果與CoMFA靜電場等勢圖顯示的結果完全一致。

3 討論

3.1 酚酸類化合物對枸杞種子萌發過程的化感自毒效應

在農業生產領域,連作障礙誘因眾多,酚酸類物質是近年來研究較多的熱點之一。枸杞種子粒徑小、種皮較薄,考察枸杞種子萌發階段對外源酚酸類物質脅迫的響應,對判斷酚酸是否為導致枸杞連作障礙的誘因具有重要意義。本研究結果顯示,酚酸類物質對枸杞萌發產生脅迫的濃度范圍(IC50數值)為39.94—115.97 mg/L。對比已有研究結果,酚酸類化合物對山桃、苜蓿、花生、水稻、人參種子萌發或幼苗生長產生顯著化感自毒效應的濃度水平分別為0.1—10 mg/L[23]、0.5—500 mg/L[22]、5 mg/L[11]、50—500 mg/L[29]、>25 mg/L[30]；由此可見,酚酸對作物產生化感效應與作物種類及濃度有關,不同酚酸對不同作物的作用閾值差異較大。

酚酸類化合物可以導致植物化感自毒作用,這一論斷一直存在爭議[5],其主要原因在于實際植物根系土壤環境中,酚酸類物質的含量多在μg/g的水平[6,24,31],顯著低于實驗室條件下獲得的抑制作用濃度水平。本研究亦發現,單一酚酸引起枸杞種子萌發過程化感自毒作用的濃度閾值較高。然而,在自然界一種作物根系中,往往共存數種酚酸類化合物[6,10,15]。有學者認為,與實驗室獲得的單一酚酸對植物的化感作用相比,復合酚酸對植物的影響更大[10]。植物殘體浸提物是復合化感物質的重要來源,但其組成復雜,對主成分定量研究及化感作用機理研究造成一定困擾。實驗室體系中復合酚酸對植物的化感作用,目前還未見報道。

3.2 酚酸類化合物抑制杞種子萌發的定量構效關系

本研究在囊括常見植物根系分泌物中酚酸類物質的同時,將部分化學分子結構類似的酚酸類化合物也納入研究范圍,應用CoMFA方法考察酚酸類物質對枸杞種子萌發過程的化感自毒活性的構效關系。結果顯示,該類化合物的立體效應和靜電效應是描述其化感自毒活性和進行構效關系研究的重要結構參數。在建模過程中,本研究也嘗試了比較分子相似性指數法,將分子的疏水性質、氫鍵供體和受體性質也納入考察范圍,發現上述三種結構描述符對酚酸化合物的化感自毒活性影響不大(數據未顯示)。

CoMFA作為3D-QSAR研究的有力工具,在環境科學、生態毒理等領域應用廣泛,本研究初步將CoMFA應用于農業生產領域的化感作用研究,獲得了較好的解析酚酸類物質化感自毒活性構效關系的定量數學模型。三維等高圖揭示出的構效關系規律可為該類化合物與生物體作用產生毒性作用機理的探討提供理論依據。

4 結論

在較高濃度水平,外源酚酸對枸杞種子的萌發均產生抑制作用,分別以抑制種子萌發、胚根生長和胚軸生長作用計,IC50數值范圍為78.88—115.97、56.47—81.72、39.94—80.56 mg/L；其中,阿魏酸、2,3-二甲氧基肉桂酸、咖啡酸等含有甲氧基、羥基官能團的肉桂酸衍生物抑制作用較強。基于CoMFA方法構建酚酸化合物分子結構與其對枸杞種子萌發化感作用的構效關系,獲得模型的交叉驗證系數Q2為 0.802,非交叉驗證系數R2為0.938,證明模型穩健可靠；三維等勢圖揭示出酚酸類化合物立體效應和靜電效應是描述其化感自毒活性的重要參數。

致謝：本研究工作得到中國科學院生態環境研究中心杜宇國和魏東斌研究員的幫助，特此致謝。