miR-454-3p靶向BPTF表達調控肺癌細胞A549增殖、遷移和侵襲

籍佳琦，高凌云，付澤偉，李熙霞，楊麗青，劉文媛，汪 英

目前，肺癌已經成為中國男性發病率和病死率最高的腫瘤之一[1]，盡管肺癌的靶向治療取得飛速發展，其5年生存率依舊較低，不足16%[2]，癌細胞的侵襲轉移是造成肺癌病死率居高不下的主要原因[3]。微小RNA(miRNA)是近年發現的一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼短鏈RNA，許多miRNA與腫瘤細胞增殖、遷移侵襲等有關[3]。miRNA通過調控靶基因的表達，在多種腫瘤的發生、發展過程中發揮促癌或抑癌基因的作用。目前已有研究證實，miR-454-3p在膀胱癌、乳腺癌等腫瘤中表達降低，對人類腫瘤的發生、發展中具有重要的負向調控作用[4-5]。但是miR-454-3p在肺癌發生、發展中的功能和機制卻知之甚少。本文旨在驗證miR-454-3p在肺癌細胞株中低表達，其過表達顯著抑制肺癌細胞株的增殖、遷移和侵襲能力及其對BPTF的靶向調控作用，闡明miR-454-3p在肺癌發生、發展中的作用，以期為肺癌的臨床靶向治療提供新的潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年6月～2018年11月四川省人民醫院(東院)手術切除經液氮保存的新鮮冷凍組織，包括33例肺腺癌組織及相應癌旁正常組織，癌旁選取距離病變部位>2 cm組織。本實驗經本院倫理委員會批準，患者均知情并簽署同意書，所有標本均經兩位病理醫師確診。

1.2 實驗材料人肺癌細胞系(H1437、A549、H1299、H1975、H460)、正常肺上皮細胞(HBE)和293T細胞，均購自美國ATCC細胞庫。DMEM、RPMI 1640、DMEM-F12培養基和胎牛血清(FBS)，均購自Gibco公司。胰酶購自Sigma公司，引物購自南京金斯瑞公司。PrimeScript RT Reagents Kit逆轉錄試劑盒和SYBR Premix EX Taq，均購自日本Takara公司。miR-454-3p mimic、雙熒光素酶報告基因試劑盒，均購自廣州銳博公司。Transwell試劑盒購自美國BD公司。CCK-8試劑盒購自東仁化學科技公司。抗體BPTF(1 ∶1 000)、MMP-2(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶2 000)、E-cadherin(1 ∶2 000)、N-cadherin(1 ∶2 000)、GAPDH(1 ∶5 000)，均購自美國CST公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養和傳代 H1437、A549、H1299、H1975和H460細胞培養于含有10%FBS的DMEM培養基，HBE培養在含有10% FBS的RPMI 1640培養基中。所有細胞置于37 ℃、5%CO2的培養箱內。細胞融合率達90%時，移去培養液并用FBS緩沖液沖洗2次。加入適量胰酶消化后，加入2 mL培養基中止消化。輕輕吹打至細胞脫落，將懸浮細胞離心(1 000 r/min×5 min)，重懸后繼續培養。

1.3.2 miR-454-3p mimic轉染A549細胞取對數期生長細胞接種到6孔板中，當細胞生長70%～80%融合度時，采用Lipofectamine 3000轉染細胞；轉染前用Opti-MEM培養基分別稀釋Lipofectamine 3000和miR-454-3p，混勻，室溫下孵育5 min，加入培養基中轉染細胞。轉染48 h后收集細胞，采用RT-PCR檢測轉染效率。

1.3.3 RT-PCR采用Trizol試劑盒提取總RNA，定量，反轉錄試劑盒反轉成cDNA。RT-PCR采用 SYBR Premix EX Taq。采用2-ΔΔCt法定量，U6作為內參。

1.3.4 Western blot法miR-454-3p mimic轉染A549細胞48 h 后，收集細胞。使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠垂直電泳，轉膜，5%脫脂牛奶孵育封閉1 h，用稀釋后的一抗過夜孵育，TBST洗膜10 min×3次，HRP標記的二抗孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化學發光法顯影后曝光，相關圖像分析軟件進行灰度值測定，以GAPDH為內參。

1.3.5 CCK-8實驗取對數期生長的A549細胞，分別轉染miR-454-3p及其對照24 h后，胰酶消化后制備單細胞懸液，并計數。向96孔板中加入100 μL含細胞數約為2 000個的培養基，培養24、48、72、96 h后，向每孔中加入10 μL的CCK8溶液，繼續培養2 h，酶標儀測定450 nm的吸光度值。

1.3.6 遷移和侵襲實驗非基質膠覆蓋和基質膠覆蓋的Transwell小室實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力，將各組細胞胰酶消化后，離心，用不含血清的培養基重懸，計數，制備成單細胞懸液。接種3×104個細胞至上室，下室中加入700 μL的20% FBS的培養基，培養24 h。用棉簽擦去上室未穿過孔膜的細胞，4%多聚甲醛固定10 min，15%結晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察，隨機選6個視野，計數穿膜細胞，平均細胞表示細胞的遷移能力。侵襲實驗與遷移實驗的區別是在接種細胞前，上室預鋪Matrigel基質膠。

2 結果

2.1 miR-454-3p在肺癌組織以及肺癌細胞株中的表達RT-PCR檢測結果顯示，miR-454-3p在肺癌組織中表達明顯低于癌旁正常組織，與癌旁正常組織中的表達相比，差異有顯著性(P<0.01，圖1)。與人正常肺上皮細胞(HBE)相比，miR-454-3p在肺癌細胞系(H1437、 A549、 H1299、H1975和H460)中的表達明顯下調(P<0.05)，其中A549的表達量最低(圖2)。

圖1 miR-454-3p在肺癌和癌旁肺組織中的表達

圖2 miR-454-3p在不同肺癌細胞系和正常細胞中的表達水平比較

2.2 過表達miR-454-3p對A549肺癌細胞增殖的影響鑒于miR-454-3p在A549的表達含量最低，因此選擇A549作為實驗對象。miR-454-3p mimic轉染A549細胞后，RT-PCR定量結果顯示，過表達組(轉染miR-454-3p的mimics)A549細胞中miR-454-3p的表達含量明顯高于對照組(轉染mimics-NC)，差異有統計學意義(P<0.001，圖3A) CCK8檢測結果顯示，miR-454-3p mimic處理顯著抑制肺癌細胞A549的增殖(P<0.05，圖3B)。

圖3 A549細胞轉染miR-454-3p mimic后miR-454-3p表達水平(A)及對細胞活力的影響(B)

2.3 上調miR-454-3p與A549肺癌細胞遷移和侵襲的關系采用遷移和侵襲實驗檢測過表達miR-454-3p對細胞遷移和侵襲能力的影響。無基質膠的Transwell小室實驗結果表明，與對照組相比，miR-454-3p過表達組細胞侵襲能力明顯下降(圖4A)。Transwell小室實驗檢測A549細胞的侵襲能力，結果顯示：過表達miR-454-3p也顯著抑制細胞的侵襲能力(圖4B)。以上實驗結果提示過表達miR-454-3p可顯著抑制A549肺癌細胞遷移和侵襲能力。

圖4 上調miR-454-3p能抑制A549肺癌細胞遷移(A)和侵襲(B)

2.4 miR-454-3p與BPTF 3′UTR的關系miR-454-3p在肺癌細胞系中的低表達，提示其可能是抑癌miRNA。生物信息學軟件Targetscan和miRanda分析結果表明，miR-454-3p在BPTF 3′ UTR之間有良好的配對關系(圖5A)，在此基礎上構建野生型和突變型的BPTF真核表達載體。雙熒光素酶報告基因結果表明：miR-454-3p能顯著降低BPTF 3′ UTR熒光素酶活性(P<0.01，圖5B)，Western blot檢測結果進一步顯示，在A549細胞中過表達miR-454-3p可以顯著降低BPTF的表達(圖5C)，差異有統計學意義 (P<0.05)。

圖5 miR-454-3p直接靶向BPTF：A. miR-454-3p與BPTF 3′UTR互補配對序列；B.各組細胞中熒光素酶活性的比較：1.miR-454-3p-NC+BPTF-WT；2.miR-454-3p-mimic+BPTF-WT；3.miR-454-3p-NC+BPTF-MUT；4.miR-454-3p-mimic+BPTF-WT，ns為兩組之間差異無統計學意義；C.Western blot法檢測A549細胞中BPTF蛋白的表達水平

2.5 miR-454-3p調控A549肺癌細胞遷移和侵襲相關蛋白的表達Western blot法檢測結果表明，與對照組相比，miR-454-3p過表達組中遷移相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達降低。此外，miR-454-3p過表達顯著抑制侵襲相關蛋白N-cadherin，而N-cadherin的負向調控蛋白E-cadherin的表達顯著增加(圖6)。

圖6 Western blot法檢測A549細胞遷移和侵襲相關蛋白的表達

3 討論

隨著腫瘤生物治療研究的不斷加深和進步，從分子生物學角度尋找肺癌進展及轉移的靶向治療已成為目前研究的熱點[6]。miRNA是一類高度保守的內源性短鏈mRNA，通過與靶基因3′UTR相結合，降解靶基因mRNA或者抑制其翻譯調控基因的表達[7-8]。越來越多的miRNA如miRNA-421、miRNA-527 被報道參與肺腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學行為[9-10]。miR-454-3p是近年發現的參與多種腫瘤過程的miRNA，miR-454-3p通過靶向抑癌基因BTG1增強腎癌細胞對放療的敏感性[11]，miR-454-3p在膀胱癌組織和細胞系中表達下調，可通過下調ZEB2基因的表達，抑制癌細胞增殖并抑制細胞侵襲和轉移[12]。以上研究提示miR-454-3p的表達失調或功能異常在肺癌的發生、發展中可能扮演重要的角色，但miR-454-3p在肺癌中的功能及機制研究未見報道。

本實驗結果顯示，miR-454-3p在肺癌組織和肺癌細胞中的表達均低于正常肺組織和肺上皮細胞，提示miR-454-3p可能具有抑制肺癌細胞生長的作用，本實驗選取表達含量最低的肺癌細胞A549為實驗對象，轉染miR-454-3p的mimics上調其表達，結果發現高表達miR-454-3p明顯抑制肺癌細胞的增殖，同時降低癌細胞的遷移和侵襲能力。EMT是具有上皮表型的細胞在特定的病理生理情況下轉化為具有間質表型細胞的過程，表現為丟失上皮細胞表型E-cadherin，增加vimentin和N-cadherin等間質表型，從而使細胞黏附力下降，遷移和侵襲能力增加[13]。Western blot結果顯示，miR-454-3p過表達可以上調細胞中上皮細胞表型E-cadherin蛋白表達，間質表型N-cadherin蛋白表達下調，提示miR-454-3p可能抑制肺癌EMT的進展，進而抑制細胞的遷移和侵襲能力。 此外，本實驗利用Targetscan和miRanda數據庫預測miR-454-3p的靶基因，最終選定BPTF作為miR-454-3p的候選靶基因。BPTF溴區PHD結構域轉錄因子，近年研究發現其在人類多種腫瘤中高表達，參與腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等過程，與腫瘤的發生、發展及轉移能力密切相關[14-15]。BPTF在肺癌細胞中的研究報道較少。本實驗進一步構建含BPTF 3′UTR序列的熒光素酶報告重組質粒，再進行雙熒光素酶報告基因分析，共轉染后熒光素酶的活性受到抑制，提示miR-454-3p可直接與BPTF基因的3′UTR相結合。A549細胞瞬轉入miR-454-3p的mimics后，Western blot檢測發現BPTF蛋白表達降低， 以上結果表明miR-454-3p可以負向調控BPTF，抑制其表達。

綜上所述，在肺癌細胞中miR-454-3p呈低表達，上調miR-454-3p能抑制BPTF蛋白表達、抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲。以上結果為miR-454-3p在肺癌中的調控機制提供了實驗依據，但是miR-454-3p在肺癌中的臨床意義仍有待于進一步探討。