子宮頸癌中miR-153和Survivin的表達及其臨床意義

周成友，杜 陽，趙 靜，李 良

子宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在發展中國家的發病率較高[1]。近年子宮頸癌的發病趨勢逐漸年輕化，且早期無明顯體征，病變發展至晚期全身會出現衰竭癥狀，嚴重影響患者的生活質量，因此有效的早期篩查和診斷危險因素可預防子宮頸癌變，并為后期及時治療提供依據[2]。Survivin是位于17號染色體q25區的生存素，眾多學者認為其有望成為腫瘤治療的靶點[3]；miRNA是一類長約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與生物體細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等多種關鍵調控，其異常表達與子宮頸癌、卵巢癌等婦科腫瘤的發生、發展密切相關[4-5]。目前，miRNA具體作用機制尚未明確[6]。miR-153和Survivin在子宮頸癌組織中的作用機制及相關性尚未見報道，本實驗檢測子宮頸癌和正常子宮頸組織中miR-153、Survivin的相對表達量，分析兩者之間的關系及其與子宮頸癌臨床病理特征的關系，為子宮頸癌分子篩查、診斷、治療及預后評估提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本收集2011年1月～2016年1月在我院行手術切除并經病理確診的50例子宮頸癌組織標本，患者年齡30～71歲，平均(50.40±12.23)歲；按2018國際婦產科聯盟(FIGO)標準分期：Ⅰ期7例，ⅡA期6例，ⅡB期13例，Ⅲ期24例；腫瘤直徑≥4 cm者30例，<4 cm者20例；腫瘤類型：內生結節型27例，菜花型23例；無淋巴結轉移者17例，有淋巴結轉移者33例。另選取40例因子宮肌瘤行子宮切除患者的正常子宮頸組織作為對照組，患者年齡30～73歲，平均(49.10±13.06)歲。兩組患者臨床資料差異無統計學意義(P>0.05)。

納入標準：(1)經組織活檢及術后病理檢查確診為子宮頸癌患者，且均確診為鱗癌；(2)術前均未服用抗腫瘤藥物或接受任何放、化療患者；(3)病理和隨訪資料完整者；(4)均未合并其他腫瘤或癌前病變者。排除標準：(1)肝、腎等重要器官功能嚴重不全者；(2)合并其他惡性腫瘤或感染性疾病者；(3)非HPV病毒感染的子宮頸癌患者；(4)術后3年內失訪者。

1.2 主要試劑All-in-one miRNA qRT-PCR Detection Kit 試劑盒、PCR引物，均購自奧科生物公司；Recover All Total Nucleic Acid Isilation Kit for FF-PE脫蠟試劑盒，購自Thermo fisher SCIENTIFIC公司；兔抗人Survivin多克隆抗體，購自北京中杉金橋公司；PBS溶液，購自北京中杉金橋公司；二氨基聯苯胺顯色劑及載玻片，均購自武漢博士德公司。

1.3 方法

1.3.1RT-PCR 采用RT-PCR法檢測轉染效果，Trizol法提取組織中的總RNA，按照RecoverAll Total Nucleic Acid Isilation Kit for FF-PE脫蠟試劑盒說明書步驟提取核酸，按All-in-one miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書步驟制備逆轉錄反應體系。所有引物均由奧科生物公司設計合成，用2-ΔΔCt法計算miR-153的相對表達量。

1.3.2免疫組化 采用免疫組化SP法染色，取各組標本制作石蠟切片，按常規方法脫蠟、包埋、切片。將切片置于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)中加熱修復抗原15 min，取出用0.01 mol/L PBS溶液沖洗3次；加入3%過氧化氫溶液孵育25 min，再用PBS溶液沖洗5次；加入5%山羊血清，室溫封閉10 min，滴加Survivin一抗置于4 ℃冰箱中過夜；次日PBS沖洗3次，滴加Survivin二抗室溫孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵蛋白工作液孵育30 min，PBS沖洗3次。二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，脫水、透明和封固，置于鏡下觀察。另以空白PBS液作陰性對照。

1.4 結果判斷隨機觀察每張切片10個高倍鏡下不重復視野，根據細胞染色程度和染色細胞的百分率進行綜合評分。根據細胞染色強度計分：無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；根據陽性細胞百分率計分：<10%為0分，10%～40%為1分，41%～70%為2分，>70%為3分；將上述兩項得分相加：總分≥2分為高表達，反之為低表達。

1.5 隨訪對子宮頸癌患者隨訪3年，在我院長期治療的患者復查詳細病理資料，未在本院進行復查的患者采用電話隨訪進行聯系，主要記錄分析對象的總生存時間。

2 結果

2.1 子宮頸癌和正常子宮頸組織中miR-153、Survivin的表達本組結果顯示：miR-153在子宮頸癌組織中的相對表達量明顯低于正常子宮頸組織，而Survivin在子宮頸癌組織中的相對表達量明顯高于正常子宮頸組織，差異均有統計學意義(t=16.333、t=6.407，P均<0.01，表1)；免疫組化染色可見Survivin蛋白表達主要位于基底層細胞(圖1)；通過散點圖及相關性分析，發現子宮頸癌組織中miR-153和Survivin的相對表達量呈負相關，差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。

表1 子宮頸癌和正常子宮頸組織中miR-153、Survivin的表達

圖1 A.子宮頸癌組織中Survivin的表達，SP法；B.正常子宮頸組織中Survivin的表達，SP法

圖2 子宮頸癌組織中miR-153、Survivin表達的相關性

表2 miR-153、Survivin表達與子宮頸癌臨床病理特征的關系

2.2 miR-153、Survivin表達與子宮頸癌臨床病理特征的關系子宮頸癌中miR-153、Survivin的表達與患者年齡、腫瘤大小、TNM分期均無關(P>0.05)，與淋巴結轉移明顯相關(χ2=6.455，χ2=5.937，P均<0.05，表2)；且通過散點圖及相關性分析，發現淋巴結轉移者其受侵數目與miR-153表達量之間呈負相關，與Survivin表達量之間呈正相關，差異均有統計學意義(P<0.01，圖3)。

圖3 A.子宮頸癌中miR-153表達與淋巴結轉移數目的相關性；B.子宮頸癌中Survivin表達與淋巴結轉移數目的相關性

2.3 miR-153、Survivin表達與子宮頸癌患者預后的關系隨訪50例子宮頸癌患者3年，無失訪，隨訪率為100%。miR-153高表達患者生存率(73.33%)明顯高于低表達患者(45.71%)；Survivin高表達患者生存率(45.95%)明顯低于低表達患者(76.92%)，差異有統計學意義(χ2=19.390，χ2=27.921，P均<0.001，圖4)。

圖4 A.子宮頸癌中miR-153表達與患者3年生存率的關系；B.子宮頸癌中Survivin表達與患者3年生存率的關系

3 討論

近年受病毒感染、生物學因素、分娩次數及其他眾多因素的影響，子宮頸癌的發病趨勢呈逐年上升趨勢，但其發病機制尚不清楚。研究表明，眾多基因、蛋白均會參與子宮頸癌的發生、發展[7-10]，且miRNA的異常表達與婦科腫瘤的抑癌或促癌關系密切[11]。內源性短鏈RNA能夠通過與靶基因部分或完全互補抑制其翻譯或令其降解，從而在轉錄后水平沉默基因表達的作用。miRNA家族作為基因表達調控網絡中的重要組成部分，參與多條信號通路的調控，而對其靶基因的確定及功能分析是理解miRNA作用機制的關鍵。因此，本實驗通過檢測miR-153和Survivin在子宮頸癌組織和正常子宮頸組織中的表達水平，探討其在子宮頸癌中的作用機制，預測其在臨床中的作用。

miR-153是新近發現與腫瘤密切相關的miRNA之一，在不同的腫瘤組織中其表達不盡相同。miR-153在導管腺癌、乳腺癌、骨肉瘤中表達明顯下調，可抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲；而在結直腸癌中高表達，會間接增強腫瘤細胞的侵襲能力，促進疾病發展[12-14]，目前還未見miR-153在子宮頸癌中的相關分析。本實驗發現，miR-153在子宮頸癌組織中的相對表達量明顯低于正常子宮頸組織(t=16.333，P<0.01)；進一步分析miR-153與子宮頸癌臨床病理特征的關系，miR-153表達與子宮頸癌患者年齡、腫瘤大小、TNM分期無關(P>0.05)，但與淋巴結轉移相關(χ2=6.455，P<0.05)；通過相關性分析發現，淋巴結轉移患者其受侵數目與miR-153表達之間呈負相關(P<0.01)；通過miR-153表達水平與患者的生存情況分析，miR-153高表達患者生存率、中位生存期(73.33%、24個月)明顯高于低表達患者(45.71%、17個月)，差異有統計學意義(χ2=19.390，P=0.01)。以上結果說明miR-153表達水平下調可能促進子宮頸癌細胞增殖，并對子宮頸癌的發生、發展及轉移起關鍵作用。

Survivin是目前篩選分離的分子量最小，但凋亡抑制活性最強的抑制因子，通過對半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7活性的抑制發揮抗凋亡作用，通過對細胞周期的調控促進腫瘤細胞的增殖。有關文獻報道Survivin在胃癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤中均高表達[15-16]。本實驗發現，Survivin在子宮頸癌組織中的相對表達量明顯高于正常子宮頸組織(t=6.407，P均<0.01)；通過散點圖及相關性分析，發現在子宮頸癌組織中miR-153和Survivin表達量呈負相關(P<0.01)；進一步分析Survivin與子宮頸癌臨床病理特征的關系，Survivin表達與子宮頸癌患者年齡、腫瘤大小、TNM分期無關(P>0.05)，與淋巴結轉移相關(χ2=5.937，P<0.05)；通過相關性分析發現，淋巴結轉移患者其受侵數目和Survivin表達量之間呈正相關(P<0.01)；通過分析Survivin表達水平與患者生存曲線發現，Survivin高表達患者生存率、中位生存期(45.95%、16個月)明顯低于低表達患者(76.92%、25個月)，差異有統計學意義(χ2=27.921，P<0.01)。以上結果說明在子宮頸癌組織中Survivin相對高表達會抑制子宮頸癌細胞凋亡、改變細胞周期，使癌細胞增殖過度，導致子宮頸癌的發生、發展。

綜上所述，miR-153在子宮頸癌組織中表達下調，且與Survivin表達呈負相關，可能調控Survivin表達，促進腫瘤的發生、發展，但由于本實驗樣本數較少，關于miR-153的具體調控Survivin機制及信號通路尚需后續深入探討。