PASM-Masson套染在腎穿刺活檢中的應用

喻 宏，孫 炎，李曉星，茍繼周，羅偉仁

腎穿刺活檢組織病理診斷是腎臟疾病診斷以及鑒別的重要方法，包括常規HE染色、特殊染色、免疫熒光染色及電鏡檢查等。其中，特殊染色是腎穿刺活檢組織的重要輔助檢查方法，主要包括PAS染色、PASM染色、Masson染色以及剛果紅染色等。在日常工作中，如果對穿刺腎組織分別進行染色，所需時間長，工作量大，不利于病理醫師鏡下觀察免疫復合物沉積及其位置[1]。相反，PASM-Masson套染能夠在同一張切片中準確顯示病變腎小球內各種免疫復合物的形態與定位，明顯縮短了染色時間，提高了工作效率，對診斷腎小球疾病起重要作用[2]。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年1～12月深圳市第三人民醫院(南方科技大學第二附屬醫院)病理科存檔的腎穿刺活檢標本109例，組織均經10%中性福爾馬林固定(pH 7.0)，固定時間12～24 h。常規脫水、透明、石蠟包埋后，切片。切片厚1.5 μm，70 ℃烤箱烤片40 min。

1.2 試劑Bouin固定液(飽和苦味酸 ∶甲醛 ∶冰醋酸=15 ∶5 ∶1)，購自廣州凱秀貿易公司。Masson試劑盒(包括鐵蘇木精、麗春紅酸性品紅工作液、苯胺藍、磷鉬酸)，購自廣州維格斯公司。六胺銀染色試劑盒(高碘酸、硼砂溶液、硝酸銀六次甲基四胺粉劑)，購自珠海貝索(BASO)公司。

1.3 染色方法將腎穿刺組織石蠟包埋后，1.5 μm厚切片，70 ℃烤片40 min。切片入二甲苯脫蠟梯度乙醇入水，1%高碘酸氧化30 min，蒸餾水沖洗。切片置于六胺銀工作液35 min(60 ℃水浴箱孵育)，觀察切片呈金黃色，終止染色，蒸餾水沖洗。0.1%氯化金脫色數秒，鏡下觀察至金黃色消失，基膜呈明顯黑色，蒸餾水沖洗。3%硫代硫酸鈉定影1 min，蒸餾水沖洗。Bouin液補充固定(37 ℃水浴箱4 h)。鐵蘇木精15 min，熱水藍化30 s。蒸餾水沖洗，Masson液30 min，蒸餾水沖洗。1%磷鉬酸分化5 min，不用水洗，直接甩掉磷鉬酸后加入1%苯胺藍5 min。蒸餾水沖洗，加入1%醋酸分化2 min。高濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結果

PASM-Masson套染結果顯示，切片背景干凈，結構清晰，腎小球基膜、腎小管基膜和毛細血管基膜均呈黑色或棕黑色，細胞間質以及膠原纖維呈藍黑色，紅細胞、腎小管上皮細胞及免疫復合物呈紅色(圖1、2)。

圖1 膜性腎小球腎炎(3期)：腎小球毛細血管袢基膜外側見大量“釘突”形成(箭頭)；基膜呈黑色，免疫復合物“釘突”呈紅色

圖2 糖尿病腎?。好氀芑こ屎谏的ぜ毎g質以及膠原纖維增生呈藍黑色(箭頭)

3 討論

特殊染色是鑒別腎臟疾病，顯示腎組織內某些特殊成分的重要方法[3]。PASM染色法主要是觀察腎穿刺組織中腎小球基膜、毛細血管袢基膜的病變程度，Masson染色主要是觀察腎小球內免疫復合物沉積、系膜基質、基膜及腎間質膠原纖維增生程度。在臨床工作中發現，如僅單獨對腎穿刺組織進行PASM染色或Masson染色，很難對基膜病變與免疫復合物病變進行準確定位，不利于判斷兩者是否存在于同一部位。PASM-Masson套染既可以顯示腎小球毛細血管和腎小囊基膜在炎性損傷中的改變細節，也可以觀察免疫復合物的沉積[4]。實際操作中常規的六胺銀染色背景過深，Masson染色對腎小球內的免疫復合物顯色淡，基膜和膠原纖維對比不清晰。我科通過采取延長高碘酸氧化時間至30 min，充分暴露基膜內黏多糖中的醛基，加深金屬銀的顯色對比度；之后Masson染色用Bouins液補充固定，一方面固定液中的苦味酸可軟化過硬的纖維組織，使麗春紅等大分子染料能穿透進入，另一方面使之pH環境降低，讓膠原纖維、紅細胞、免疫復合物著色鮮艷，與基膜著色對比清晰。

作者在實際工作中發現，切片厚度以1～1.5 μm效果最好。切片太厚(3 μm以上)，不宜觀察基膜病變的組織和結構，如腎小球結構不清楚，“釘突”病變結構顯示變得模糊。在PASM-Masson套染過程中，Bouins液、六胺銀工作液及Masson液溫度可自行調節，浸染效果更方便把控。此外，需控制PASM工作液和Masson液染色時間，每個步驟結束均需鏡下觀察染色程度及時進行調節。如PASM染色需要微鏡下觀察到腎小球基膜的著色，背景無明顯著色即可終止。不宜著色過深，否則會影響后續的染色并人為增加基膜的非特異性著色。另外，高濃度乙醇脫水耗時較少，耗時較多則會導致Masson脫色。Masson染色淺染或過染均可以原步驟返回重新染色。

經本科室改良的PASM-Masson套染，對病變定位準確、背景清晰，對比明顯，有利于病理醫師觀察腎小球基膜病變及免疫復合物的定位。此外，套染方法快速、簡便，可以減少染色時間，提高工作效率，具有一定的臨床診斷應用價值。