妊娠梅毒患者外周血T/B/NK 淋巴細胞亞群檢測及分析

魏 然，馬 萍，車雅敏

（1.天津醫科大學總醫院皮膚性病科，天津300052；2.天津市第二人民醫院皮膚性病科，天津300192）

梅毒是由梅毒螺旋體引起的一種慢性性傳播疾病。近年來，伴隨梅毒發病率的增加，妊娠梅毒已經成為重要的醫學問題和公共衛生問題。妊娠梅毒以潛伏梅毒為主，多在妊娠期體檢時發現，目前國內對于妊娠梅毒的免疫學研究較少，發病機制與細胞免疫功能的關系，至今尚不明確。為探討妊娠梅毒發病的免疫學相關機制，本研究應用流式細胞儀對12 例未經驅梅治療的妊娠梅毒及16 例血清固定的妊娠梅毒進行外周血T 淋巴細胞、NK細胞及B 淋巴細胞檢測，并與12 例梅毒非妊娠女性、32 例健康孕婦、25 例健康非妊娠女性進行比較，以了解妊娠梅毒患者的免疫狀態并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集天津市第二人民醫院感染二

科2018 年5 月-2018 年10 月的妊娠合并梅毒患者共28 例。妊娠梅毒的診斷標準與非妊娠人群相同，參考2014 版中國性傳播疾病臨床診療及防治指南，同時測定甲苯胺紅不加熱血清試驗（tolulized red unheated serum test，TRUST）和梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（treponemal pallidum particle agglutination，TPPA），兩項均為陽性的孕婦即確診為妊娠合并梅毒[1]。其中未經驅梅治療者12 例，年齡18～33 歲（25.2±4.0），全部為潛伏梅毒；經治療后發生血清固定者16 例，年齡22～36 歲（25.4±3.6），其中既往為一期梅毒1 例，潛伏梅毒15 例。梅毒非孕婦組為12例梅毒血清學陽性的未妊娠女性，年齡21～40 歲（28.3±6.30）。健康孕婦組為32 例正常體檢孕婦，年齡21～35 歲（27.2±3.5）。正常對照組為25 例健康體檢女性，年齡20～39 歲（27.4±3.9）。5 組年齡構成無統計學差異（F=1.516，P＞0.05）。梅毒血清固定診斷標準:早期梅毒治療后,按規定時間隨訪如血清仍不轉陰,或超過2 年血清不轉陰者稱為血清固定[2]。所有標本均排除自身免疫性疾病、過敏性疾病、合并感染HIV 或其他性病、嚴重系統性疾病和應用免疫抑制劑史。

1.2 儀器與試劑 FACSCaliburTM流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司）；FACS Lysing 紅細胞裂解液，單克隆抗體：CD16+/CD56+PE、CD3+PerCP/CD4+FITC/CD8+PE 三色熒光抗體、CDl9+FITC、CD45+PerCP（美國Becton Dickinson 公司）。

1.3 檢測方法 取靜脈血2 mL 肝素抗凝，在新EP管加入全血100 μL、單克隆抗體試劑20 μL 混勻，室溫避光孵育20 min，加入2 mL 紅細胞裂解液混勻，放置10 min。2 h 內上機檢測。

1.4 統計學分析 采用SPSS 17 統計學軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，多組均數比較采用χ2分析，若存在統計學差異，則進一步采用LSD 檢驗作組間兩兩比較；兩組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

與其他4 組相比，血清固定組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+細胞比例均顯著降低（P＜0.05），CD8+細胞比例顯著升高（P＜0.05）；未治療組CD4+細胞比例低于健康孕婦組（P＜0.05），CD8+細胞比例高于梅毒非孕婦組、健康孕婦組和健康非孕婦組（P＜0.05）；未治療組和血清固定組CD19+細胞比例均高于梅毒非孕婦組、健康孕婦組和健康非孕婦組（P＜0.05）；血清固定組NK 細胞比例高于未治療組（P＜0.05）；梅毒非孕婦組、健康孕婦組和正常非孕婦組各項淋巴細胞亞群水平無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 5 組人群外周血淋巴細胞亞群比較（±s，%）Tab 1 Comparison of peripheral blood lymphocyte subgroups in 5 groups(±s，%)

表1 5 組人群外周血淋巴細胞亞群比較（±s，%）Tab 1 Comparison of peripheral blood lymphocyte subgroups in 5 groups(±s，%)

與健康非孕婦組相比，△P＜0.05;與健康孕婦組比較，*P＜0.05;與梅毒非孕婦組比較，?P＜0.05;與未治療妊娠梅毒組相比，§P＜0.05

組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD19+ NK血清固定妊娠梅毒組 71.02±8.21*§△ 36.85±4.72*?§△ 36.52±5.70*?§△ 1.17±0.30*?§△ 12.90±3.20*?△ 9.76±3.25§未治療妊娠梅毒組 76.86±4.44 45.41±5.60* 32.27±2.57*?△ 1.58±0.41 13.27±3.29*?△ 7.42±2.36梅毒非孕婦組 74.76±6.38 46.18±5.10 25.81±4.31 1.54±0.22 10.55±2.97 /健康非孕婦組 77.71±3.96 48.27±4.39 27.94±3.15 1.57±0.31 9.58±2.48 /健康孕婦組 77.43±6.96 50.84±10.20 28.65±5.90 1.49±0.45 10.11±2.46 /F 3.643 10.813 12.309 3.712 6.327 P 0.008 0.000 0.000 0.008 0.000 0.04

3 討論

近年來，妊娠梅毒已成為一個值得關注的公共衛生問題，不同文獻所報道的孕婦人群中患病率約為3.7%～23.3%[3]。以往研究認為，梅毒螺旋體在妊娠16 周以前不易穿過滋養層細胞對胎兒造成感染，妊娠16 周后，滋養層細胞逐漸萎縮退化，喪失屏障作用[4]。但近年來的研究表明，在妊娠早期梅毒螺旋體即可感染胎兒，導致流產、早產、死胎等不良妊娠結局[5]。一項關于妊娠梅毒患者發生不良妊娠結局的薈萃分析顯示，未接受驅梅治療的妊娠梅毒患者發生流產、死胎的概率上升21%，新生兒死亡率上升9.3%，15%的新生兒發生先天梅毒[6]。有多項研究報道指出目前妊娠梅毒患者以潛伏梅毒為主，這一趨勢仍在逐年增加[7-8]。

梅毒的病情發生發展與機體發揮免疫功能密切相關，固有免疫、細胞免疫及體液免疫協同作用保護機體減少再感染，同時造成梅毒臨床癥狀的多樣性。有研究表明，細胞免疫對梅毒的病程發展具有重要影響，梅毒患者存在細胞免疫功能抑制和失衡現象，細胞免疫功能低下不僅可增加TP 再感染的機會，而且造成TP 的隱匿性感染，增加神經梅毒的易感性，影響病情的發展和轉歸[9-10]。CD4+和CD8+細胞亞群由T 淋巴細胞分化而成。CD4+細胞能分泌多種細胞因子，介導遲發型超敏反應，對于清除梅毒螺旋體起到決定性作用；CD8+細胞對保護性免疫反應具有抑制作用。CD4+/CD8+是反映機體炎癥反應和免疫情況的初步指標，在正常狀況下人體CD4+/CD8+水平相對穩定[11]。凌昕等[12]對梅毒血清固定患者及神經梅毒患者外周血檢測發現，兩組均表現為CD4+細胞下降和CD4+/CD8+比值下降。本研究中血清固定組外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平顯著降低，CD8+水平高于其他3 組，表明存在T 淋巴細胞亞群平衡失常，造成免疫抑制，減弱機體對梅毒螺旋體的清除作用，這種免疫失衡也是疾病預后不良的重要標志之一[13]。妊娠期母體免疫功能處于耐受狀態，以避免對胎兒的排斥。因此，梅毒螺旋體感染狀態下妊娠可能是加重免疫失衡的影響因素之一[14]。有少數研究也發現較未經治療的梅毒患者，發生血清固定的梅毒患者出現外周血CD4+細胞、CD4+/CD8+比值顯著減少，CD8+細胞顯著增加，這種比例失衡現象可能是造成快速血漿反應試驗（rapid plasma regain，RPR）持續陽性的原因之一[15]。近年來有研究指出，CD8+細胞水平異常不僅可拮抗CD4+介導的免疫反應，同時還抑制TP 制動抗體的產生，引發梅毒螺旋體的復制和擴散[16]。因此有研究者認為在梅毒常規治療的基礎上加用免疫調節劑可以明顯改善治療效果[17]。已有多項研究證實在梅毒血清固定患者中加用糖皮質激素治療可以有效抑制炎癥反應，調節免疫功能，具有更好的臨床療效且不良反應可控[18-19]。此外，也有研究者采用雙向免疫調節劑胸腺五肽通過調節外周血T 淋巴細胞比例使免疫機能恢復至正常范圍[20]。

CD19+表達于所有B 細胞表面，是B 細胞的重要膜抗原，通過與B 細胞抗原受體（B cell receptor，BCR）結合可溶性抗原，經內吞和加工后，以抗原肽（major histocompatibility complex，MHC）分子復合物形式提呈給T 細胞，CD19+反映了機體的體液免疫功能[21]。在凌昕等[12]研究中，梅毒血清固定患者和神經梅毒患者CD19+比例有所上升，但沒有統計學差異。對各期梅毒患者的CD19+細胞水平進行檢測，結果往往與健康對照組無異，甚至在高滴度二期梅毒中出現顯著下降，這種降低也可能與高滴度抗體形成的反饋抑制作用有關[21-22]。與之不同的是，本研究中未經驅梅治療及治療后發生血清固定的妊娠梅毒患者外周血CD19+水平均高于梅毒非孕婦組、正常對照組與健康孕婦組，提示妊娠狀態下梅毒螺旋體感染對患者的體液免疫產生影響。B 細胞在梅毒免疫中有雙向調節作用，并與T 細胞介導的細胞免疫密切相關，但參與免疫失衡及免疫抑制的具體作用機制尚不明確[23]。

NK 和巨噬細胞構成機體免疫監視的第一道防線，在清除TP 方面發揮重要作用，同時也具有將固有免疫與獲得性免疫相聯系的作用[24]。本研究中，相較于未治療組，血清固定組NK 細胞升高。雖然在正常孕婦及健康體檢者中未檢測NK 細胞，但有以往研究表明，育齡期既往潛伏梅毒的血清固定女性患者外周血NK 細胞水平顯著低于健康人群，提示因其免疫防御功能受損導致梅毒螺旋體感染演化為慢性遷延性[25]。顏霞等[26]發現各期梅毒患者均存在NK 細胞水平顯著降低的現象。但在二期梅毒皮損中，大量的梅毒螺旋體會引發復雜的炎性細胞免疫應答，其中巨噬細胞發揮重要作用，活化的NK 細胞可顯著升高至正常人的5 倍，通過分泌IFN-γ 參與活化皮膚中的巨噬細胞[27]。

綜上所述，本研究雖然樣本量較小且未對妊娠結局及胎傳梅毒的發生率進行跟蹤隨訪，但仍可說明妊娠梅毒患者存在免疫功能受損及免疫失衡現象，對梅毒免疫學機制的認識及免疫療法的探索實踐還有待進一步研究。