毛竹肉桂酰輔酶A還原酶基因PeCCR功能初步研究

徐 浩，楊克彬，朱成磊，李 英，高志民

(國際竹藤中心，竹藤資源基因科學與基因產業化研究所，國家林業和草原局/北京市竹藤科學與技術重點開放實驗室，北京 100102)

竹子是我國最具價值的森林資源之一，在保障生態安全、木材安全等方面均發揮著重要作用。竹材優良的材性，是由竹子生長遺傳和環境共同決定的，不同竹種及同一竹種不同產地的竹材材性存在著較大差異[1-3]。雖然竹材材性不同程度地受到不同撫育墾復措施[4]、施肥[5-6]、鉤稍[7]等栽培措施的影響，但遺傳差異是決定材性的主要內在因素。木質素含量是影響木材材性的重要因素，木質素生物合成涉及多種結構基因、調節基因和miRNA[8-10]。人們已經從遺傳角度來研究竹子的材性特征，并開始借助分子生物學手段研究竹材材性的生物合成調控，如參與竹子木質素生物合成的基因CoCOMT[11]、PePAL1[12]、C4H[13]和PeLAC[14]等，參與纖維素合成的PeCesA1～7[15]，參與木聚糖合成的PeIRX9和PeIRX10[16]等。雖然對這些基因僅是初步研究，但對認識竹子木質素的生物合成以及竹材材性的遺傳調控分子機制具有重要意義。

肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)是木質素合成的特異途徑中的關鍵酶之一，該酶以3種羥基桂酸的輔酶A酯(香豆酰輔酶A、阿魏酰輔酶A、芥子酰輔酶A)作為底物，催化生成相應的肉桂醛，在木質素生物合成中起主導作用[17]。關于CCR基因及其編碼蛋白的研究，已在擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)、水稻(Oryza sativaL.)、小麥(Triticum aestivumL.)和玉米(Zea maysL.)等多種植物中開展[18]；而對竹子CCR基因的研究僅有2例報道，即從七彩紅竹(Indosasa hispidaM. cv. Rainbow)克隆了IhCCR-1[19]和從巴拉圭瓜多竹(Guadua paraguayanan)中得到了GpCCR基因，并研究了GpCCR在不同組織中的表達模式[20]。然而，對于竹子CCR基因功能研究尚未得到深入開展。本研究以毛竹 (Phyllostachys edulis(Carrière) J. Houz.)為研究對象，克隆PeCCR基因，利用實時定量PCR技術對其在不同組織中以及不同高度筍中的表達情況進行了分析，并利用在擬南芥異位表達的方法對其功能進行了初步研究，以期為揭示CCR基因在竹子木質素生物合成中的功能以及對竹材材性形成的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以毛竹為對象，分別以實生苗(0.5 a)和野外毛竹為材料，其中，前者是用購買自廣西桂林的毛竹種子在實驗室條件下播種培養(培養基質為腐殖土∶蛭石=6∶4，溫度≈25℃，光照強度≈300 μmol·m-2·s-1)的毛竹，取不同組織樣品用于基因表達組織特異性分析；后者是直接采取江西南昌 (28°45'58'' N，115°45'39'' E，海拔 399.0 m)野外生長的毛竹，選取不同發育階段的竹筍(0.2、1.0、3.0、6.7 m)，取筍基部 (生根節的上部約 1 cm處切取竹壁，約1 cm×1 cm)為樣品，一部分用FAA固定液固定，用于切片觀察；另一部分用液氮淬凍處理后用干冰運回實驗室，存放于-80℃冰箱，用于RNA提取。

1.2 不同高度筍切片觀察

取上述經FAA固定液固定的毛竹筍樣品，按照文獻[21]方法，用聚乙二醇( PEG)將材料固定，制作切片(厚度 10～15 μm)，用0.05%的甲苯胺藍O (TBO)染液染色后鏡檢觀察，拍照記錄。

1.3 RNA分離與cDNA的合成

將上述所取毛竹實生苗不同組織樣品和野外毛竹筍的樣品，在液氮中研磨成粉末，采用Trizol試劑，按照文獻[22]方法提取各樣品的總RNA，按照反轉錄試劑盒操作說明書(Promega公司)合成cDNA，存-20℃用于基因表達模式分析和克隆。

1.4 基因定量表達分析

根據毛竹CCR基因(PH01001334G0240)序列設計定量引物qPeCCR-F和qPeCCR-R(表1)。以毛竹PeNTB作為內參基因[23]，分別以毛竹實生苗不同組織樣品和野外毛竹筍不同樣品的cDNA為模板，進行PeCCR基因表達的定量分析。采用Roche Light Cycler?480 SYBR Green I Master試劑盒在耶拿公司QTower儀器上進行qRT-PCR實驗，反應體系 (10 μL)為：5.0 μL 的 2×SYBR Green I Mastermix，0.8 μL cDNA，正向引物和反向引物各 0.2 μL(10 μmol·L-1)，加 ddH2O 至反應總體積為10.0 μL。 qPCR 程 序 ： 95℃10 min； 95℃ 10 s；60℃10 s；共 40 個循環。并應用 2-△△Ct算法[24]分析實驗結果。另外，利用前期本實驗室毛竹葉、早花期花序、晚花期花序、地下莖、根、筍20 cm及筍50 cm等7個不同組織的轉錄組數據[25]，分析PeCCR在不同組織中的表達情況。

表 1 PCR擴增所用引物Table 1 Primers used in PCR

1.5 基因克隆與載體構建

根據PeCCR序列(PH01001334G0240)的編碼區序列和植物表達載體pC1301-35S-OCS[26]的多克隆位點，設計基因克隆引物(PeCCR-F和PeCCR-R)和添加酶切位點(BamHⅠ和XbaⅠ)的載體構建引物 (PeCCR-F1和 PeCCR-R1)(表 1)。以毛竹筍cDNA為模板，用PeCCR-F和PeCCR-R擴增，獲得編碼區的片段。經測序驗證正確后，以測序正確的質粒為模板用PeCCR-F1和PeCCR-R1擴增，采用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切將PeCCR1連接到植物表達載體pC1301-35S-OCS的多克隆位點，形成植物過量表達載體。

1.6 轉基因擬南芥植株的篩選與分子鑒定

將過量表達載體pC1301-35S-PeCCR-OCS質粒轉入農桿菌(Agrobacterium tumefaciensSmith &Townsend)菌株GV3101中，培養并獲得陽性克隆菌株。經菌液PCR驗證正確后，對單克隆陽性菌株進行培養，按照蘸花法[27]轉化模式植物擬南芥(Col-0)，并收獲種子 (T0代)。用潮霉素 (Hyg,50 μg·mL-1)對T0代種子進行篩選，獲得抗性植株并用PCR進行檢測驗證，繼續用潮霉素篩選至純合的轉基因植株作為后續實驗的材料。采用半定量RT-PCR方法驗證在轉基因擬南芥中的表達情況，同時以擬南AtUbiquitin(NM180850)為內參基因[28]。

1.7 轉基因擬南芥的表型分析與木質素含量測定

播種純合的轉基因擬南芥株系，直接觀察植株生長的表型變化。取生長6周的植株基部蓮座葉以上2 cm的擬南芥莖，用7%瓊脂固定后，進行切片制作(厚度約40 μm)，經用0.05%的TBO染色后制作臨時切片，觀察擬南芥莖中木質素的情況。

另外，取基部蓮座葉以上3 cm的擬南芥莖，用溴乙酰法測定其中木質素的含量，參照齊一生物科技(上海)有限公司的木質素含量檢測試劑盒(貨號：QYS-237008)說明書進行，同時以同期的野生型擬南芥作為對照。按照以下公式計算木質素含量（mg·g-1）：

式中：ΔA為測定管OD280值-空白管OD280值；V反總為反應總體積2.04 mL；W為樣本質量；T為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 PeCCR克隆與分析

用引物 PeCCR-F和 PeCCR-R進行 PCR擴增，產物電泳結果顯示：約在1.0 kb出現1條特異條帶，與預期目的基因大小一致，回收、克隆并送公司測序。測序結果表明：目的基因序列長度為1 026 bp，序列與毛竹基因組數據庫中PH01001334 G0240和NCBI數據庫中毛竹cDNA(FP099901.1)的編碼區完全一致，命名為PeCCR。該基因編碼一個341 aa的蛋白，該蛋白包含肉桂酰輔酶A還原酶家族蛋白特有的保守結構域“NWYCYAK”，以及植物CCR特有的NAD(P)結合位點和識別區[17](圖 1)。

2.2 PeCCR基因的組織表達特異性分析

根據毛竹轉錄組數據[28]中PH01001334G0240的RPKM值，分析發現：PeCCR在毛竹鞭、20 cm筍和50 cm筍中沒有檢測到表達，在根和葉中表達的RPKM值分別為2.380 64和1.832 46。由此表明，在不同組織中的表達存在明顯差異。利用qRT-PCR方法對實驗室毛竹實生苗不同組織中PeCCR的基因表達分析表明：PeCCR在各個組織中均有表達，但表達量差異明顯，其中，在莖中的表達最低，根中表達量最高，其次是筍芽和葉片，在葉鞘和未展開葉中的表達量比較相近且相對較低(圖2)。這與轉錄組數據PeCCR在根中的RPKM值最高相一致，但不同于筍中沒有檢測到表達。

2.3 竹筍木質化程度與PeCCR表達分析

對毛竹筍樣品的TBO染色鏡檢觀察表明：隨著毛竹筍高度的增加，維管束的染色加深區域明顯逐漸擴大，尤其是厚壁細胞顏色明顯逐漸加深，表明筍的木質化程度逐漸加強(圖3)。筆者推測PeCCR的表達與竹子的木質化有關，參與木質素的生物合成，為此，對PeCCR在不同高度筍中的表達進行了定量分析。結果（圖4）表明：PeCCR在0.2 m筍中的表達量相對較低，在1.0 m筍中迅速上升(約是0.2 m筍中的16倍)，3.0 m筍中基本保持1.0 m筍中的水平，而6.7 m筍中PeCCR的表達量又有所上升，約是0.2 m筍中的18倍。由此表明，PeCCR基因的表達隨著筍高度的增加呈上升趨勢，這與竹筍的木質化程度逐漸加深相一致。

圖 1 PeCCR的核酸序列及其推導的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PeCCR

2.4 PeCCR載體構建與驗證

以測序正確的PeCCR質粒為模板，用PeCCRF1和PeCCR-R1擴增的結果表明，獲得了預期目的片段(圖略)。回收、克隆并送公司測序表明，目的片段包含了酶切位點BamHⅠ和XbaⅠ序列及PeCCR的編碼區序列。采用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切將PeCCR連接到植物表達載體，形成過量表達載體 pC1301-35S-PeCCR-OCS(圖 5A)，質粒酶切(圖5B)進一步證明獲得了正確的PeCCR植物過量表達載體。

2.5 轉PeCCR擬南芥檢測與表型分析

將pC1301-35S-PeCCR-OCS質粒轉入農桿菌，并轉化擬南芥。對獲得的純合株系表型分析發現，與野生型相比，轉PeCCR基因植株葉片明顯增大，且抽苔時間提前3～4 d，由此表明：過量表達PeCCR促進了轉基因株系的生長發育。利用RT-PCR對獲得轉基因植株中PeCCR表達進行了半定量分析，電泳結果（圖6）顯示：在2個轉基因株系中均檢測到PeCCR基因表達，而野生型擬南芥中未檢測到PeCCR基因表達，且2個轉基因株系(Line1和Line2)中PeCCR基因的表達量不同，轉基因株系Line1中的表達量高于Line2。

圖 2 PeCCR在毛竹不同組織中表達分析Fig. 2 Expression analysis of PeCCR in different tissues of moso bamboo

圖 3 毛竹不同高度筍維管束的橫切面Fig. 3 Transverse sections of vascular bundle in bamboo shoot with different heights.

圖 4 PeCCR在毛竹不同高度筍中表達分析Fig. 4 Expression analysis of PeCCR in bamboo shoots with different heights

圖 5 PeCCR過量表達載體(A)及其酶切檢測(B)Fig. 5 Overexpression vector of PeCCR (A) and its detection with enzyme digestion (B)

莖的橫切組織化學染色觀察顯示：轉PeCCR基因植株中木質部和束間纖維組織的染色面積均大于野生型(圖7)，說明轉基因植株莖中的木質素多于野生型植株。采用乙酸-溴乙酰法對PeCCR1轉基因株系木質素含量測定結果（圖8）表明：2個過表達PeCCR轉基因株系中的木質素含量均明顯高于野生型，L1和L2分別為對照的123.1%和116.7%，且L1高于L2，這與組織化學染色法取得的結果相一致，也和2個株系中PeCCR的表達量相一致。由此表明，過表達PeCCR基因促進木質素的生物合成，木質素含量增加達到顯著性水平(p＜0.01)。

3 討論

圖 6 轉基因植株中PeCCR基因表達的分析Fig. 6 Gene expression analysis of PeCCR1in transgenic plants

圖 7 擬南芥莖橫切面Fig. 7 Transverse sections of Arabidopsis stem overexpressing PeCCR

圖 8 過量表達PeCCR擬南芥莖木質素含量分析Fig. 8 Lignin content analysis of Arabidopsis stem overexpressing PeCCR

目前，木材安全已經上升到我國國家戰略的高度，隨著天然林保護政策的實施，木材供給不足的問題日益突出。竹材已成為木材資源的重要替代品，有效緩解了木材的供需矛盾，在我國區域經濟發展和生態保護當中都發揮著不可替代的作用。研究竹材形成的分子機制，對于未來竹子的分子育種具有重要價值。毛竹基因組草圖的發表與數據應用[25,29]，為從毛竹中克隆目的基因，研究其功能提供了方便。本研究克隆了木質素生物合成途徑中的關鍵酶基因PeCCR，其編碼蛋白長度(341 aa)比七彩紅竹的IhCCR-1 (345 aa)和巴拉圭瓜多竹(354 aa)略短，但都含有CCR家族特有的蛋白保守結構域，是CCR家族成員之一。毛竹CCR家族包含17個成員[30]，在基于毛竹、水稻和擬南芥CCR氨基酸序列構建的系統進化樹中，毛竹各CCR成員均與單子葉植物水稻聚類到較近的位置，而與擬南芥的距離相對較遠(圖略)，這與前期研究相一致[31]，且PeCCR與水稻的OsCCR4 (OS09G04050)聚類在一起，二者的蛋白相似系數為88.2%，而OsCCR4是功能性CCR的候選者[32]，表明PeCCR與OsCCR4可能具有相似的功能。

基于轉錄組數據的表達譜和實時定量PCR的結果都表明，PeCCR在毛竹根中的表達豐度最高，與小麥的Ta-CCR2(AY771357.1)在根中表達豐富[33]相類似。切片組織化學染色結果表明，毛竹筍的木質化程度隨著筍高度的增加而不斷加強，且其中PeCCR的基因表達量呈上升趨勢，這與小麥處于木質化的根中Ta-CCR2高表達相一致[33]。研究表明，體外重組Ta-CCR2蛋白對阿魏酰CoA、5-OH-阿魏酰CoA、芥子酰CoA和咖啡酰CoA具有幾乎相似的轉化效率，表明它參與愈創木基木質素(guaiacyllignin, G型木質素)和紫丁香基木質素(syringyllignin, S型木質素)合成[33]。PeCCR與Ta-CCR2的氨基酸序(AAX08107.1)一致性為87.1%。在擬南芥中過量表達PeCCR，促進了轉基因植株的生長發育和開花提前，顯著提高其莖中木質素含量，進一步表明具有參與木質素生物合成的功能。另外，研究表明，CCR基因還能通過影響微纖夾角來影響木材材質的密度和硬度[34]。由此表明，毛竹材性形成過程中，PeCCR可能是通過參與調控木質素含量、木質素單體比例等多個方面來影響其材性的，但其在毛竹中的具體功能有待于深入研究。

4 結 論

本研究從毛竹克隆了PeCCR基因，用RTPCT技術證明該基因在毛竹實生苗不同組織中存在表達差異；在野外隨竹筍高度的增加，木質化程度加強，PeCCR基因表達量上調；在擬南芥中過量表達PeCCR，促進了轉基因植株的生長發育，開花提早，木質素含量增加。本研究對于深入研究竹子木質素合成調控與竹材材性形成機制具有重要參考價值。