不同種源白櫟果實形態特征和營養成分含量變異分析

熊仕發，吳立文，陳益存，高 暝，周新華，汪陽東＊

(1. 中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400；2. 南京林業大學，江蘇 南京 210037；3. 中國林業科學研究院亞熱帶林業實驗中心，江西 分宜 336600)

白櫟（Quercus fabriHance）為殼斗科（Fagaceae）櫟屬（QuercusL.）的一種落葉喬木[1]，廣泛分布于我國亞熱帶的15個省份，是我國亞熱帶森林的主要天然次生樹種和優勢樹種。白櫟木材紋理致密美觀，耐磨耐腐，常被用作建材、家居的高級用料，且其木材結構細膩耐燒、燃燒釋放熱值高、煙量少，是傳統薪炭材[2]。白櫟嫩葉可飼養柞蠶，老葉可作飼料[3]。白櫟果實又稱橡實，是一種傳統的野生木本糧食資源，可用來開發食品、飼料和醫藥等[4-5]。因其具有多重用途，長期以來過度砍伐利用和粗放經營，導致白櫟林分破壞較重，現存的白櫟林高大喬木較少，主要為砍伐后其基部萌生枝條，再經封山育林而成的次生林。白櫟分布廣泛,可形成大量不同的遺傳類型。研究遺傳多樣性是資源保護與評價的重要手段，在制定育種策略和物種保存等方面有著重要意義。

利用表型性狀的差異來檢測種源的遺傳多樣性是長期以來最簡便易行的方法。林木的果實性狀是較穩定的遺傳特征，不同種源果實在表型性狀上存在的差異是植物對環境的一種適應，研究果實性狀可在一定程度上揭示種源的遺傳規律和變異程度[6]。目前，有關白櫟的研究僅分析了個別地區白櫟居群的分布格局和個別種源白櫟的生物量及果實中的礦質元素和營養成分的含量[7-8]，白櫟資源現狀未得到全面調查和了解，其遺傳多樣性和遺傳結構尚未展開系統研究。本文以14個白櫟種源368個單株的果實為研究對象，初步揭示果實形態與營養成分含量在種源間、種源內的變異及其與地理氣候因子的關系，為白櫟良種選育及種質資源的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年10—12月，在白櫟自然分布區10個省的14個地點采集成熟果實用于試驗。采種母樹樹齡大于30 a，無病蟲害，生長正常且處于盛果期，每個單株按東、西、南、北4個方向均勻采集樹冠中上的果實，盡量減少由不同生境造成的統計差異。采種母樹間距在50 m以上，每個種源地采集母樹數量20～30株不等，單株采果不少于200 g[9]。果實剝去殼斗后，分種源等質量均勻混合，攤開自然晾干，后于(105±5)℃下烘干至恒質量，清理干凈后粉碎，密封置于4℃冰箱貯藏備用。采用GPS測量種源的經緯度，氣象數據來自中國氣象數據網（1981—2010年）（表1）。

1.2 果實形態特征測定

選用果實長度、果實寬度、長寬比及百粒質量作為形態特征指標。每個種源隨機選出100粒無蟲蛀的健康果實，采用電子游標卡尺測量果實長度和果實寬度，重復3次，測量單位精確到0.01 mm，并計算果實長寬比。再用電子天平稱量100粒無蟲蛀的健康果實質量，重復5次，取平均值并精確到0.01 g。

1.3 果實營養成分測定

蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定[10]，脂肪含量采用索氏提取法測定[11]，總黃酮含量和單寧含量采用分光光度比色法測定[12]，可溶性糖和淀粉含量測定采用蒽酮比色法測定[13]，每個指標測定均設置3次重復。

1.4 數據處理與統計分析

1.4.1 巢式方差分析和多重比較 對原始數據進行正態性檢驗，發現數據服從正態分布。采用巢式方差分析[14]研究白櫟果實性狀變異，線性模型為：χijk=μ+αi+δj（i）+εijk，其中，χijk為第i個種源的第j個個體的第k個觀測值，μ為總平均值，αi為第i個種源的效應值，δj（i）為第i個種源內的第j個個體的效應值，εijk為隨機誤差，并利用Duncan方法進行多重比較[15]。

表 1 14個白櫟種源的地理位置及主要氣象因子Table 1 Geographic location and habitat of 14 provenances of Q. fabri

1.4.2 多樣性參數的計算 在R語言統計軟件中計算各性狀的變異系數（CV）、表型分化系數（Vst）和Shannon-Wiener指數（H）。CV可以說明性狀的離散程度和種源間的分化程度，，其中，σ、分別為性狀的標準差和均值。Vst可描述表型變異在種源間貢獻的大小，），其中，分別為種源間和種源內方差值。Shannon-Wiener指數（H）=-ΣPiln（Pi），Pi=ni/N，Pi表示某性狀第i個代碼值出現的概率，ni為某表型性狀出現的次數，N為樣本數[16]。

1.4.3 相關性分析、主成分分析和聚類分析 Excel2016軟件整理數據，DPS15.10軟件中進行相關性分析、主成分分析和聚類分析。采用Pearson相關性分析法對果實的10個特征參數間以及與采集地生態因子進行相關性分析。主成分分析，通常選取主成分的個數為包含80%以上信息的變量，即特征根的累積貢獻率大于80%。聚類分析，對原始數據進行標準化處理，采取極差正規化方法：從數據矩陣的每個變量中找出其最大和最小值，二者之差稱為極差，然后從每個原始數據中減去該變量中的最小值，再除以極差，即經變換后，每列的最大數據變為1，最小數據變為0，其余數據取值在0～1，基于可變類平均法和絕對值距離作群體間的聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同種源白櫟果實形態特征和營養成分含量變異

2.1.1 果實形態特征 不同種源白櫟果實形態特征統計分析結果表明（表2）表明：14個白櫟種源平均果實長度、果實寬度、長寬比及百粒質量分別為 22.30 mm、11.48 mm、1.96和 152.41 g，其平均變異系數分別為5.10%、6.40%、7.68%和2.65%，其中，百粒質量的變異系數最小，說明百粒質量的變異幅度相對于其它性狀較小，百粒質量性狀的穩定性較高。白櫟果實長度的變化范圍為20.72～24.60 mm，其中，重慶江津種源果實最長，江西宜黃種源最短，前者是后者的1.19倍；果實寬度的變化范圍為10.69～14.53 mm，其中，浙江遂昌種源果實最寬，四川閬中種源最窄，前者是后者的1.36倍；長寬比的變化范圍為1.67～2.17，其中，浙江武義種源最大，浙江遂昌種源最小，前者是后者的1.30倍；百粒質量的變化范圍為121.24～249.45 g，其中，浙江遂昌種源最大，四川鄰水種源最小，前者是后者的2.06倍。果實形態特征方差分析結果（表3）表明：白櫟果實的形態指標果實長度、果實寬度、長寬比和百粒質量在種源間和種源內的差異均達到極顯著水平（P＜0.01），說明白櫟果實各形態特征在種源間和種源內均存在一定程度的變異。為進一步確定白櫟果實形態特征的變異來源，采用巢式方差分析，得到其在種源間和種源內的方差分量百分比及表型分化系數，結果（表3）顯示：4個形態特征在種源間的表型分化系數變幅為27.98%～40.75%，均值為34.03 %；各性狀的平均方差分量百分比分別為種源間25.59%、種源內48.64%、隨機誤差25.77%，說明白櫟果實形態特征在種源間和種源內均存在不同程度的變異，種源內的變異是其形態特征變異的主要來源，即種源內的多樣性程度大于種源間。

表 3 白櫟表型性狀的方差分量及種源間表型分化系數Table 3 Variation components and phenotypic differentiation coefficients among Q. fabri provenances

Shannon-Wiener指數（H）可以反映不同性狀的豐富度和均勻度，對14個白櫟種源的4個形態特征進行多樣性指數分析（表4），發現14個白櫟種源的 Shannon-Wiener指數（H）在 1.734～1.916之間，均值為1.839,多樣性指數從高到低依次為：SCLS＞GZHP＞CQJJ＞ZJSC＞HNXH＞FJWYS＞GXQZ＞SCLZ＞HNLS＞ZJWY＞CQWZ＞JXYH＞HBLC＞ZJXH。4個形態特征的Shannon-Wiener指數均值分別為：果實寬度（1.886）＞果實長度（1.837）＞長寬比（1.832）＞百粒質量（1.801），總體看，4個形態特征的多樣性差別不大，果實寬度的多樣性略高于其它性狀。

2.1.2 營養成分含量 對白櫟果實蛋白質、淀粉、可溶性糖、單寧、脂肪和總黃酮含量進行方差分析（表5），發現這些營養成分含量在14個白櫟種源間的差異均極顯著（P＜0.01），說明白櫟果實不同營養成分含量在種源間存在著豐富的遺傳多樣性。蛋白質含量變化范圍為22.63～92.65 mg·g-1，其中，重慶江津種源蛋白質含量最高，福建武夷山種源蛋白質含量最低，前者是后者的4.09倍；淀粉含量變化范圍為29.03%～59.73 %，其中，四川閬中種源淀粉含量最高，浙江武義種源淀粉含量最低，前者是后者的2.06倍；可溶性糖含量的變化范圍為4.93%～10.96%，其中，湖南龍山種源可溶性糖含量最高，廣西全州種源可溶性糖含量最低，前者是后者的2.22倍；單寧含量的變化范圍為48.23～101.73 mg·g-1，其中，重慶萬州種源單寧含量最高，浙江遂昌種源單寧含量最低，前者是后者的2.11倍；脂肪含量的變化范圍為0.33～1.87 mg·g-1，其中，浙江遂昌種源脂肪含量最高，重慶萬州種源脂肪含量最低，前者是后者的5.67倍；總黃酮含量的變化范圍為0.92～2.72 mg·g-1，其中，福建武夷山種源總黃酮含量最高，浙江西湖種源總黃酮含量最低，前者是后者的2.96倍。白櫟果實6種營養成分含量的平均變異系數為17.8%～47.1%，其中，總黃酮含量的變異系數最大，為47.1%，其余依次為脂肪含量（39.8%）、蛋白質含量（37.7%）、單寧含量（29.2%）和可溶性糖含量（21.3%），淀粉含量的變異系數最小（17.8%）。

表 4 14個白櫟種源果實表型性狀的Shannon-Wiener指數Table 4 Shannon-Wiener indexes of phenotypic traits of 14 provenances of Q. fabri

表 5 14個白櫟種源果實營養成分含量及多重比較Table 5 Nutrient content and multiple comparisons of 14 provenances of Q. fabri

2.2 不同種源白櫟果實特征參數間及其與地理氣候因子的相關性

不同種源白櫟果實特征參數間存在一定的相關性，表6表明：白櫟果實長度與長寬比呈顯著正相關，果實長度與果實寬度、百粒質量呈極顯著正相關，說明果實越長、寬度越大其質量也越大；果實寬度與百粒質量呈極顯著正相關，說明果實越寬其質量越大；果實淀粉含量與脂肪含量呈顯著正相關，與可溶性糖和單寧含量呈極顯著負相關，表明隨著淀粉含量的增加，脂肪含量呈增加的趨勢，可溶性糖和單寧含量呈降低的趨勢；脂肪含量與可溶性糖含量呈顯著負相關，與單寧含量呈極顯著負相關，表明隨著脂肪含量的增加可溶性糖和單寧含量都呈降低的趨勢。不同種源白櫟果實特征參數與地理氣候因子的相關分析表明（表7）表明：僅總黃酮含量與1月均溫呈顯著正相關，果實的其它特征參數與地理氣候因子的相關性均不顯著。

2.3 不同種源白櫟果實的主成分分析和聚類分析

對不同種源白櫟果實的10個特征參數進行主成分分析（表8），得到3個特征值大于1.000的主成分，它們的貢獻率依次為42.521%、24.326%、16.517%，累積貢獻率為83.364%，保留了原始性狀的大部分信息。第1主成分中載荷量較大的因子由大到小依次為淀粉含量＞百粒質量＞脂肪含量，主要反映了果實的質量性狀；第2主成分主要包含果實長度、果實寬度和單寧含量；第3主成分主要包含長寬比和蛋白質含量。基于第1主成分、第2主成分繪制散點圖（圖1），發現白櫟不同種源的地理分布對白櫟果實形態特征及營養成分含量影響較大，其中，浙江遂昌種源受地理因子影響較大。

表 6 不同種源白櫟果實各特征參數間的相關關系Table 6 Correlations among fruit character parameters of different provenances of Q. fabri

表 7 不同種源白櫟果實各特征參數與地理氣候因子間的相關分析Table 7 Correlations between fruit character parameters and ecological factors of different provenances of Q. fabri

將10個特征參數的原始數據進行標準化轉換，采用可變類平均法，對14個白櫟種源進行Q型聚類分析，結果（圖2）顯示：可將白櫟種源劃分為3類，其中，湖北利川、四川鄰水、四川閬中、貴州黃平、湖南新晃、江西宜黃和廣西全州種源為第一類，其特點是果實形態較小，個體質量較小，蛋白質和淀粉含量高；重慶萬州、重慶江津、湖南龍山、福建武夷山、浙江武義、浙江西湖種源為第二類，其特點是果實形態較大，個體質量大，可溶性糖、總黃酮和單寧含量高；而浙江遂昌種源單獨列為一類，其果實遠大于其它種源，百粒質量最大。

3 討論

3.1 白櫟果實特征參數的多樣性及變異規律

一個樹種分布區域廣，由于突變、自然選擇和隔離等原因，分化并產生了種內不同的地理生態種源[17]，表型性狀的變異既受遺傳控制，也受環境因素影響[18-20]。白櫟的自然分布東至浙江，西至云南，南至廣東，北至陜西南部，復雜的生境和地理隔離使得白櫟的某些性狀在不同種源間產生了遺傳分化。表型變異是生物遺傳變異最直接的表現，也是遺傳多樣性研究的重要內容之一[21-22]，選用果實進行表型性狀多樣性的研究，可在一定程度上反映不同群體的變異大小和遺傳多樣性水平[23-24]。本研究表明，14個白櫟種源果實形態特征在種源內和種源間均差異極顯著，營養成分含量在種源間差異極顯著，這與國內對其它櫟類樹種，如麻櫟（Q.acutissimaCarruth）、蒙古櫟（Q. mongolicaFisch. ex Ledeb）和栓皮櫟（Q. variabilisBl.）等果實性狀的種源變異研究結果基本吻合[25-27]，這些差異是種源選擇和良種選育的基礎。白櫟果實6種營養成分含量變異系數的變幅為17.8%～47.1%，均值為32.15%，4個形態指標變異系數的變幅為2.65%～7.68%，均值為5.46%，其營養成分含量的平均變異系數遠大于果實形態的平均變異系數，說明白櫟果實形態特征相對營養成分含量來說較穩定。白櫟種源的平均表型分化系數為34.03%，說明白櫟種源表型變異在種源間的貢獻率為34.03%，在種源內的貢獻率為65.97%，種源內的變異高于種源間，變異的來源主要為種源內。研究表明[28]，異花授粉的植物交配系統可以促進種源間的基因交流，增大有效群體規模，減少基因漂變對遺傳結構的影響。白櫟為風媒異花授粉，授粉能力強，可以進行較遠距離擴散，從而增進了種源間的基因流動；白櫟結實量多，果實成熟時自然脫落，易被野生動物取食、搬運，促進了基因流的流動，從而減少了種源間的差異。這與大多數林木種源的表型變異來源相同，即種源內的變異是變異的主要來源，如格木（Erythrophleum fordiiOliv）（21.56%）[16]、砂生槐 （Sophora moorcroftiana（ Benrh.） Baker）（39.25%）[29]、板栗（Castanea mollissimaBl.）（23.42%）[30]等。遺傳多樣性可以反映某一性狀的不同表現等級和數量分布，在形態多樣性研究中，多樣性指數越高表明形態性狀的多樣性越豐富。白櫟果實形態特征的Shannon-Wiener指數（H）均值為1.839，與垂珠花（Styrax dasyanthaPerk）表型遺傳多樣性指數（1.894）接近[31]，低于

格木表型多樣性指數（2.0278）[16]和滇楸（Catalpa fargesiiBur. f. duclouxii（Dode）Gilmour）表型多樣性指數（1.918）[32]，大于7種蘭屬（CymbidiumSw.）表型多樣性指數（1.037）[33]，其中,四川鄰水、貴州黃平種源的多樣性指數較高，可作為種質資源收集保存和多樣性保護的重點區域。

表 8 白櫟果實特征參數的主成分分析Table 8 Principal component analysis of characteristic parameters of Q. fabri

圖 1 基于果實特征參數的白櫟天然種源關系Fig. 1 The relationship among different Q. fabri provenances based on fruit characteristic parameters

圖 2 14個白櫟種源的聚類分析樹狀圖Fig. 2 Cluster analysis of 14 provenances of Q. fabri

白櫟果實富含淀粉，還含有蛋白質、可溶性糖、脂肪、單寧、維生素、礦質元素等營養成分，是一種可開發利用的優良木本糧食資源。對蒙古櫟橡實的研究發現，其可利用的營養價值和產熱量均與玉米和高粱相近，略優于稻谷[5]。橡實淀粉經加工去除單寧就能食用，目前已利用橡實淀粉生產出多種食品，如橡子豆腐、橡子白酒、橡子掛面和橡子醬等[34]。對14個白櫟種源果實的營養成分含量進行分析，發現大部分種源的橡實淀粉含量超過50%，可將其分為3類：第一類為高淀粉含量類群，包括四川閬中、廣西全州和浙江遂昌種源，其中，四川閬中種源淀粉含量最高，約達60%，比一般糧食作物淀粉含量都高；第二類為中淀粉含量類群，包括湖北利川、四川鄰水、貴州黃平、湖南新晃和浙江西湖種源，這類群體的淀粉含量在50%～53%；第三類為低淀粉含量類群，包括重慶江津、重慶萬州、湖南龍山、福建武夷山、江西宜黃和浙江武義種源，這類群體的淀粉含量低于50%。

3.2 白櫟果實特征參數與地理氣候因子相關性及聚類結果

植物果實表型性狀和營養成分含量的地理變異規律較復雜，通常由基因型和環境因子共同決定。因此，不同的物種具有不同的變異模式，如山杏（Armeniaca sibirica（L.）Lam）表現出以經度、年降水量和年日照時間為主的變異模式[35]；長柄扁桃（Amygdalus pcdunculataPall）呈現出以平均氣溫和無霜期為主的變異模式[36]；浙江楠（Phoebe chekiangensisC. B. Shang）表現出以海拔為主的變異模式[37]。白櫟果實的10個特征參數與地理氣候因子間的相關性分析表明，大多數特征參數與地理氣候因子間的相關性不強，僅總黃酮含量與1月均溫呈顯著相關性。本研究采樣點地形差異較大，有平原、盆地和山地丘陵等，不同種源立地條件差別巨大。一些研究表明，植物果實大小會隨海拔升高而降低，可能是由環境變化引起的對可利用資源減少的可塑性響應[38]，但重慶江津和浙江遂昌都是高海拔種源，其果實反而較大，可能由于所處的小氣候有關，它們都屬于山地氣候，晝夜溫差大，白天光合作用強，夜間呼吸作用弱，營養消耗少，這有利于果實膨大和營養積累。

根據白櫟種源果實主成分分析和聚類分析結果，可將14個白櫟種源劃分為3類，發現白櫟種源并未完全按照地理距離的遠近而聚類，表型性狀具有不連續性。不同種源白櫟果實差異明顯，華東和西南地區的種源果實個體及質量均較大，而華中地區的種源果實個體和質量較小。白櫟果實形態特征及營養成分含量的地理變異在大部分地區呈現區域板塊變異模式，小部分地區則呈現隨機變異模式。各種源白櫟果實形態特征和營養成分含量均存在極顯著差異，但造成這種差異的主要原因是遺傳因素還是環境因子尚不清楚，還需進一步利用種源試驗來剖析遺傳和環境及其互作效應。

4 結論

本研究表明，白櫟果實的形態特征在種源內和種源間均差異極顯著，種源內的變異高于種源間的變異，營養成分含量在種源間均差異極顯著，說明其存在著豐富的遺傳變異，且營養成分含量的變異系數高于形態特征的變異系數。根據聚類分析結果，可將14個白櫟種源劃分為3大類群，結合營養成分含量分析結果可以看出，浙江遂昌種源果實綜合品質最好，是一個有潛力的優良種源。