基于mt DNA COI基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定

宋鮮梅，李 敏，何云川，賀海明，王新譜

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021； 2.太原師范學院 生物系，山西晉中 030619)

近年來，寧夏蔬菜種植面積達12.7萬hm2，占全區作物種植面積的10.39%，產值占種植業總產值的31.48%，蔬菜產業已成為寧夏的優勢特色產業，是區域農業經濟發展的重要支柱[1]。在寧夏蔬菜生產中番茄和黃瓜的種植面積較大，其中番茄栽培以保護地栽培為主，可周年生產。目前，粉虱危害已成為阻礙番茄可持續安全生產的重要生物災害之一[2]。煙粉虱(Bemisiatabaci)和溫室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)是中國北方地區最常見的兩種粉虱，均為番茄的重要害蟲，且在寧夏都有發生報道[3-4]。隨著種植面積的增加，品種的更替，目前寧夏粉虱害蟲的種類及煙粉虱的生物型是否變化，亟需研究確定，進而為該類害蟲的綠色防控提供科學依據。

鑒于粉虱類害蟲體型微小，形態相似，極易隨蔬菜、花卉、水果及其種苗的貿易活動遠距離傳播，且難以快速準確識別，本研究基于線粒體COI基因對寧夏各地溫室內粉虱類害蟲以及煙粉虱生物型進行分子鑒定，以期對粉虱類害蟲的快速識別、監測、防止入侵等提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2018年6-7月在寧夏銀川、永寧、賀蘭山、石嘴山、吳忠、中衛、中寧、固原等地種植的番茄、黃瓜和豆角等寄主上采集到19個粉虱種群的77個樣品，采集點分布如圖1所示。將采集的粉虱置于盛有無水乙醇的1.5 mL離心管中，-20 ℃保存，備用。粉虱樣品的具體采集信息如表1所示。

1.2 基因組DNA提取

取單頭粉虱成蟲于1.5 mL的離心管中，用適量的1×TE Buffer(solarbio)浸泡2次，每次15 min，用通用型柱式基因組提取試劑盒(康為世紀)進行總DNA的提取。用SimpliNano 2000分光光度計檢測粉虱基因組DNA質量濃度，以 OD260/OD280值確定其是否被污染。提取的DNA -20 ℃保存，備用。

圖1 寧夏粉虱采集地分布圖Fig.1 Distribution of whiteflies-collecting area from Ningxia

1.3 PCR擴增及電泳檢測

粉虱種類的鑒定：以77個粉虱樣品基因組為模板，利用通用型引物LCO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-T-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC- A-3′)進行PCR擴增，目標片段長度約為710 bp。反應體系為25 μL，其中EasyTaqMix(全式金)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板300 ng左右，加ddH2O至25 μL。擴增程序為：94 ℃預變性10 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，35次循環；最后72 ℃延伸 7 min。

煙粉虱生物型的鑒定：以其中的15個煙粉虱基因組為模板，利用通用型引物C1-J-2195 (5′-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAG-3′)和L2-N- 3014(5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATA TTA-3′)進行PCR擴增，目標片段長度約為840 bp[5]。反應體系同上。擴增程序為94 ℃預變性10 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min，35次循環；最后72 ℃延伸5 min。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。擴增產物于4 ℃保存，備用。

PCR擴增結束后，取擴增產物5 μL，用10 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳，選取與目標片段長度一致的單一片段PCR產物送北京華大基因生物技術有限公司測序。每個種群粉虱檢測3～13頭，共計92條序列。

1.4 序列分析

用Bioedit 7.2.5軟件對公司返回的序列進行分析，根據序列峰圖分別刪除兩端引物序列以及不穩定和不準確序列，以確保序列的高質量[6]。登陸NCBI查閱并下載相關粉虱mt DNACOI基因片段序列，用軟件MEGA 7.0對所測結果與相關引用序列進行比對分析。

利用軟件中的Kimura 2-parameter 模型計算種內與種間遺傳距離。以獲得的寧夏地區77條COI基因序列和巴西(煙粉虱)、西班牙(煙粉虱)、塞爾維亞(溫室白粉虱)(登錄號分別為MH186144、LN614545和MF688658)3個地區粉虱COI基因序列為靶標，黑刺粉虱(Aleurocanthusspiniferus)COI基因序列(AB615363)為外群，用軟件MEGA 7.0中鄰接法(NJ法)構建系統發育樹。以獲得的15條Q型煙粉虱COI基因序列和在NCBI下載的相關序列[序列命名：登錄號+采集地+生物型(有的無)]為靶標，同樣以黑刺粉虱COI基因序列為外群，構建系統發育樹[7-8]。系統發育樹分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis，BP)重復檢測1 000次。用DNASP 5.10軟件分析群體間的核苷酸多樣性(Pi)、核酸平均差異度(K)、單倍型多樣性(Hd)及其相應標準偏差[9]。在Network 5.0中構建單倍型網絡圖[10]。

2 結果與分析

2.1 單頭粉虱基因組質量濃度

分光光度計檢測結果顯示，所提取的單頭供試粉虱基因組A260/A280為1.7～1.9，所有基因組質量濃度均大于50 ng/μL，滿足試驗需要。

2.2 PCR擴增、序列測定以及同源性分析

PCR擴增共計獲得92條序列，分別約710 bp和840 bp，電泳檢測結果見圖2。經測序比對并提交到GenBank，獲得基因序列登錄號(表1)。92條COI基因序列與數據庫中已知的靶標種相對應的COI基因片段的同源性均為99.0%～100%，表明所獲得的COI基因序列準確可靠。所有煙粉虱序列比對，序列MK188909SHC2-1和MK411507MZC1-3與其他序列相比有1個堿基的區別，分別是第160位的T→C和第333位的G→A；同樣所有溫室白粉虱序列相比，序列MK411530YQC1-2與其他序列相比有1個堿基的區別是第12位的T→A。結果顯示：寧夏銀川市西夏區、中衛市沙坡頭區和中寧縣的粉虱為Q型煙粉虱；固原市原州區、吳忠市利通區、銀川市永寧縣和賀蘭縣等地均為溫室白粉虱；而石嘴山市大武口區既有Q型煙粉虱又有溫室白粉虱。

所測Q型煙粉虱與NCBI已知Q型煙粉虱COI基因序列對齊處理，比對長度為639 bp，得知寧夏Q型煙粉虱COI序列完全一致，序列中堿基A、T、C、G的數量分別為153、282、84和120，A+T的含量為68.08%。Q型煙粉虱以及外群黑刺粉虱mt DNACOI部分序列比對見圖3(列出序列以外的其他序列同MK281483JMC1-4Q)。可以看出寧夏乃至中國與地中海周圍國家意大利、摩洛哥、塞浦路斯等Q型煙粉虱COI序列有0～7個堿基之差，與地中海東部國家伊拉克、伊朗、阿拉伯酋長國等相差31～44個堿基，與美洲一些國家相差大于97個堿基。

M.DNA分子質量標準 DNA marker; A1-12.JMC1-1、YGYR1-1、SJZ1-1、SJZ2-1、SHC1-1、SHC2-1、ZJZ1-1、RYC1-1、MZC1-1、JQC107-5、 JQC114-1、LM94-1; B1-8.LMC141-1、LEC2-1、LEC3-1、YQC1-1、BQC1-1、CYY1-1、XPC1-1、JQC107-1

圖2 引物LCO1490/HCO2198對20個粉虱COI基因序列的擴增電泳檢測圖
Fig.2 Amplification patterns ofCOIgene in 20 whitefly species using universal

2.3 Q型煙粉虱和溫室白粉虱的種內與種間遺傳距離

基于mtDNACOI基因序列，用軟件MEGA 7.0中的Kimura 2-parameter模型計算種內與種間遺傳距離。結果顯示:Q型煙粉虱和溫室白粉虱種內遺傳距離均為0～0.001 6，種內平均遺傳距離均為0.000 1。種間遺傳距離為 0.360 7，種間遺傳距離為種內遺傳距離的3 607倍。

2.4 Q型煙粉虱和溫室白粉虱的系統發育樹分析

用于粉虱種類鑒定的77條COI基因序列和NCBI上已知且具代表性的3條COI基因序列所構建的系統發育樹見圖4。聚類分析結果表明，煙粉虱和溫室白粉虱明顯形成獨立的進化分支。由所測15條Q型煙粉虱COI基因序列和在NCBI下載的相關序列構建的系統發育樹(圖5)可以看出，煙粉虱COI基因序列首先與黑刺粉虱COI基因序列分開，被測樣本序列與FN557444ItalyQ、KF373113 XinjiangQ、DQ365874 SpainQ等36條已知Q型煙粉虱序列聚為一支，相似度為 99.45%～100%；AM944347 CyprusQ、DQ365878 IsraelQ、HQ198739 USA CaliforniaQ、AF342776 Turkey、AB297895 SyriaQ和KY441512 Costa Rica聚為一支，相似度為 99.74%～100%；KX679574Iraq、AJ510079 Pakistan、DQ133382 United Arab emirates和EU547769Iran聚為一支，相似度為 96.35%～99.61%；AY057129 Guatemala、AF340212 Argentina、DQ133370 Bolivia和KX397318 Mexico聚為一支，相似度為92.09%～98.71%；JQ305088 Bangladesh、EU760742 Cambodia、MF167658 Thailand等聚為一支，相似度為 85.94%～100%。被測樣序列與AM944347 CyprusQ所在這一支序列相似度為98.89%～ 99.17%；與KX679574 Iraq所在這一支序列相似度為94.60%～95.29%；與AY057129 Guatemala所在這一支序列相似度為83.53%～85.32%；與JQ305088 Bangladesh所在這一支序列相似度為84.07%～85.18%。

Identical=. Missing=? Indel=-

圖4 鄰接法構建的粉虱基于COI基因序列的系統發育樹Fig.4 Neighbor-joining tree based on sequences of COI gene of whitefly species

2.5 遺傳多樣性和單倍型網絡圖分析

分析的72條序列共定義22個單倍型(表2)，分別命名為Hap_1～Hap_22。單倍型的多樣性為0.625。單倍型Hap_2共享個體數最多，占總個體數的61.11%，被2個及2個以上種群共享的單倍型有Hap_3、Hap_4、Hap_6和Hap_14。總群體的Pi為0.004 883，K為31.009，Pi和K的標準差分別為0.010 05和0.067。中性檢驗結果顯示，總種群的Tajima′s D = -1.419 80，Fu’s Fs =-2.892，P>0.1，可推斷Q型煙粉虱近段歷史時期發生過種群擴張。用Network 5. 0構建單倍型網絡圖(圖6)，在所有樣本中較高頻率單倍型位于圖的左上，其余獨立的單倍型則通過短支與這幾種高頻率的單倍型相連，從地中海地區逐漸到地中海東部(圖右上)、亞洲一些國家(圖左下)或美洲國家(圖右下)呈現從高向低頻率擴散，出現明顯的進化分支，結果與系統發育樹相吻合，說明Q型煙粉虱存在種群變異。

圖5 鄰接法構建的Q型煙粉虱基于COI基因序列的系統發育樹Fig.5 Neighbor-joining tree based on sequences of COI gene of Q biotype of B.tabaci

圖6 Q型煙粉虱COI基因單倍型網絡中介圖Fig.6 Median-joining network of haplotypes of Q biotype of B.tabaci based on COI gene

3 討 論

本研究以寧夏19個不同地區種群的粉虱為試驗材料，采用通用引物LCO1490/HCO2198和C1-J-2195/L2-N-3014 擴增COI基因序列。分子鑒定結果表明，在寧夏銀川市西夏區、中衛市沙坡頭區、中寧縣、石嘴山市大武口區均有Q型煙粉虱的分布；在銀川市永寧縣和賀蘭縣、石嘴山市大武口區、固原市原州區、吳忠市利通區、有溫室白粉虱的分布，以上地區是寧夏蔬菜產業較發達的區域。除中國北方普遍發生的溫室白粉虱外，本研究明確了Q型煙粉虱在寧夏的分布情況；而近年來寧夏番茄種植區不斷加重的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)病也從側面印證了Q型煙粉虱的存在。寧夏的5個地市中，固原市因海拔較高、氣候冷涼，夏季溫度較低，屬冷涼蔬菜種植區，該區域只有溫室白粉虱分布，尚未發現Q型煙粉虱，究其原因可能與Q型煙粉虱起源于熱帶地區，冷涼地區不適宜生存。寧夏的其他4個地市，夏季干燥且溫度較高，蔬菜種植面積大，露地與保護地栽培方式并存，且大量種植的茄果類和瓜菜類蔬菜為煙粉虱提供了良好的寄主環境，利于煙粉虱的生存繁殖。

序列比對分析結果表明，寧夏不同地區的溫室白粉虱和Q型煙粉虱種內遺傳分化現象不明顯，未形成明顯的地理種群。通過系統發育樹和單倍型網絡圖可以看出，寧夏乃至中國與地中海周圍的摩洛哥、突尼斯、埃及、西班牙、希臘、意大利亞等國和非地中海地區的日本、越南、韓國、加拿大、危地馬拉等國的Q型煙粉虱聚為一支或共享一個單倍型，寧夏Q型煙粉虱所在這一支很有可能是地中海的本土種群，與地中海東部的以色列、塞浦路斯、土耳其、敘利亞共和國等國的Q型煙粉虱相似度高達98.89%～99.17%，與伊拉克、伊朗、阿拉伯聯合酋長國、巴基斯坦相似度達94.60%～95.29%，而與美洲國家的相似度低。本研究結果與滕希[11]關于“Q型煙粉虱在中國的發生現狀及其基于mtCOI序列的系統發育分析”一文中論述的中國Q型煙粉虱的來源相一致。

馬紹國等[3]報道在寧夏石嘴山市惠農區發現B型煙粉虱，而本研究中在相同地區采集的煙粉虱為Q型煙粉虱，未檢測到B型煙粉虱，且最近研究[12-13]已表明中國農區煙粉虱優勢生物型已經由B型轉為Q型，這可能與兩種不同生物型煙粉虱的競爭替代有關。很多研究表明，Q型煙粉虱比B型煙粉虱有更強的生存優勢，如Q型煙粉虱發育歷期比B型煙粉虱短，在低溫和高溫的條件下都表現出更強的生存能力，而且Q型粉虱擁有更強、更廣泛、更穩定的抗性[14-16]，二者混合發生時，經過一定的時間，Q型煙粉虱會逐漸成為優勢生物型。

4 結 論

本研究表明，寧夏銀川市西夏區、中衛市沙坡頭區和中寧縣的粉虱為Q型煙粉虱；固原市原州區、吳忠市利通區、銀川市永寧縣和賀蘭縣等地均為溫室白粉虱；而石嘴山市大武口區既有Q型煙粉虱又有溫室白粉虱。同時發現寧夏Q型煙粉虱應源于地中海本土種群。本研究結果可對不同地區粉虱的針對性防控提供依據。