天麻制劑通過腺苷途徑治療偏頭痛相關的分子機制研究

鄭海非，陳金波，宋維偉，張德福，張 穎，宋曉文，董曉夢，蘇毅鵬，魯文先，李 斌，吳欣彤

偏頭痛是一種臨床常見的、慢性的、反復發作的神經血管疾病，其發作以單側搏動性頭痛為特征，常見癥狀還包括惡心、嘔吐、畏光、恐聲、視覺障礙及自主神經功能障礙。在美國，偏頭痛發病率女性為18%，男性為6%[1]，偏頭痛目前被列為僅次于背痛的全球第二大致殘疾病，是神經功能障礙最常見的原因，嚴重影響了人類生活質量，給世界各地的醫療系統造成巨大負擔[2]。目前臨床中，應用于緩解偏頭痛發作的藥物應用最多的主要有曲坦類及非甾體類抗炎藥等，其不良反應相對較多，而中藥(traditional Chinese medicine，TCM)具有多藥、多成分、多靶點的特點，在偏頭痛的治療中已被公認具有臨床療效，雖然其確切的分子機制尚不清楚，但其不良反應相對較少，已經引起越來越多研究者的關注，諸多臨床試驗證實天麻制劑可有效緩解偏頭痛發作[3]。本實驗采用ESTG方法復制大鼠偏頭痛模型，通過免疫熒光、Western Blot、ELisa技術檢測TG、TNC、外周血中的CGRP及TG、TNC中的A1R的表達量變化來探討天麻制劑各有效成分在偏頭痛發病機制中的作用，為研究天麻制劑治療偏頭痛的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 84只SPF級雄性SD大鼠(230～260 g)，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物在濱州醫學院SPF級動物房飼養，光/暗循環飼養12 h，給予紫外線消毒后的標準顆粒和高壓蒸汽滅菌水喂養，溫度在18～25 ℃，經過至少1 w的適應，大鼠按隨機數字法分為假手術組(A組/陰性對照組)、偏頭痛模型組(B組)、舒馬普坦干預組(C組/陽性對照組，6 mg/kg·d)、天麻素干預組(D組，200 mg/kg·d)、對羥基苯甲醇干預組(E組，20 mg/kg·d)、香英蘭醇干預組(F組，70 mg/kg·d))、β-谷甾醇干預組(G組，250 mg/kg·d)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 琥珀酸舒馬普坦片(天津華津制藥有限公司)，天麻素、香英蘭醇、對羥基苯甲醇及β-谷甾醇(上海源葉生物科技有限公司)，CGRP相關的ELisa試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)，CGRP抗體、A1R抗體(美國Abcam公司)，β-actin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(博士德生物公司)，Western Blot試劑盒(博士德生物公司)、FITC-驢抗兔IgG(美國Abcam公司)。

1.2.2 主要儀器 YLS-9A生理藥理電子刺激儀(濟南益延科技發展公司)，ZH藍星腦立體定位儀及ZHRXZ柔性顱骨鉆(安徽正華生物儀器設備有限公司)，低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)，電泳儀、濕轉轉膜儀及酶標儀(美國Biorad公司)，共聚焦熒光顯微鏡(美國Biorad公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠偏頭痛模型 電刺激三叉神經節(ESTG)模型：10%水合氯醛按照0.4 ml/100 g 的劑量將大鼠進行腹腔注射麻醉，然后固定在大鼠立體定位儀上，頭頂正中去毛、消毒暴露處皮膚，以“十”字型切口依次切開皮膚、筋膜、肌肉，暴露顱骨。以大鼠前囟為基點，在旁開3 mm、后移3.2 mm處，用顱骨鉆小心鉆直徑為1.5 mm的小孔，然后將電極經此孔向內垂直輕輕插入，遇阻力后微向上抬電極約1 mm，即至TG處(以硬腦膜算起深度約為9.5 mm)。調試好刺激電極，設電刺激參數為周期200 ms，波寬5 ms，幅度10 V，刺激30 min。ESTG模型制作成功的標志為：大鼠電刺激TG側咀嚼肌收縮，口鼻分泌物增多。

1.3.2 實驗給藥 D、E、F、G組大鼠于模型制作前7 d連續每天分別給予天麻制劑各有效成分灌胃處理；C組大鼠則提前7 d連續每天給予琥珀酸舒馬普坦片灌胃；B組大鼠于模型制作前7 d連續每天分別給予生理鹽水灌胃處理；A組大鼠不進行電刺激，余處理同B組。每天1次，持續7 d。最后一次灌胃后1 h，建立ESTG模型，以上所有操作均在無菌條件下進行，操作過程保持動作輕柔、環境安靜、避免強光，室溫保持25 ℃左右，灌胃后大鼠被送回各自的籠子里，自由獲取食物和水。本次研究人員會對動物進行監測，以確保不會出現任何治療后的反胃現象。電刺激結束后30 min內處死大鼠。

1.3.3 ELisa 頸外靜脈取血2 ml注入預冷的抗凝試管中，3000 r/min離心10 min，取上層清液分裝后置于-80 ℃冰箱保存待測。按試劑盒說明檢測各組大鼠血清中CGRP水平，根據標準品的濃度及對應的吸光度(OD)值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.3.4 免疫熒光 大鼠造模成功后電刺激30 min后，開胸經左心室插管至升主動脈快速注射37 ℃生理鹽水至右心耳流出液變清、肝臟變白，多聚甲醛磷酸緩沖液灌注至大鼠肝臟變韌，肢體變僵直后取出TG、TNC對應的腦干部位，4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定12～24 h后，蔗糖梯度脫水48 h后制作冰凍切片，PBS洗滌后封閉2 h，加入一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，滴加用FITC標記稀釋(1∶100)后的IgG(二抗)37 ℃孵育4h(孵育至3.5 h后加入hoechst染色，直至4 h充分反應后展片、封片，最后將制作好的載玻片放于共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 Western Blot測定蛋白濃度 大鼠造模成功后電刺激30 min處死取TG及TNC組織，分別置于玻璃勻漿器中，加入裂解液和蛋白酶抑制劑研磨均勻，將裂解的液體以12000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清，按照BCA 法測定蛋白濃度，然后100 ℃煮沸10 min，放入-20 ℃冰箱保存備用。配置SDS-PAGE膠，在每個上樣孔中加入蛋白樣品進行電泳，然后電轉移到PVDF膜上，7%脫脂奶粉封閉2 h后加用一抗稀釋液稀釋的一抗(1∶1000)，β-actin(1∶1000)作為內參對照，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗(1∶5000)，37 ℃振蕩孵育2 h，TBST洗膜，加ECL發光劑、曝光，Image J軟件分析吸光度值(A值)，最終結果以目的蛋白A值與內參蛋白A值的比值表示。

2 結 果

大鼠最后一次灌胃1 h后，建立ESTG模型，刺激30 min后處死大鼠，頸外靜脈取血2 ml注入預冷的抗凝試管中，并正確解剖出TG、TNC，進行相關處理后，采用免疫熒光與western blot技術檢測TG、TNC中CGRP的水平及通過免疫熒光與western blot技術測定TG、TNC中A1R的水平。

2.1 天麻制劑各有效成分對大鼠偏頭痛模型中CGRP表達的影響 本實驗通過ELISA技術檢測頸外靜脈血CGRP的表達，通過免疫熒光與western blot技術檢測TG、TNC部位CGRP的表達。與A組相比，B組大鼠頸外靜脈血、TG、TNC中的CGRP表達明顯高于A組，差異具有統計學意義(P<0.01)；與B組相比，C、D組大鼠CGRP的表達量明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01)，而E、F、G組的CGRP的表達量與B組相比差異無統計學意義(P>0.05)；與C組相比，D組大鼠的CGRP表達無明顯差異(P>0.05)(見圖1～圖4、表1)。

圖1 各組大鼠外周血中CGRP 的表達量(n=12，與A組相比，B組PPP>0.05；與C組相比，D組P>0.05)

圖2 免疫熒光檢測各組大鼠TG中CGRP的表達情況(標尺均為50 μm)

圖3 免疫熒光檢測各組大鼠TNC中CGRP的表達情況(標尺均為50 μm)

圖4 Western Blot檢測各組大鼠TG、TNC中CGRP的表達情況(n=6，與A組相比，B組PPP>0.05；與C組相比，D組P>0.05)

表1 各組大鼠TG、TNC中CGRP的表達情況

n=6，χ±s，與A組相比B組P<0.01；與B組相比C、D組P<0.01，而E、F、G組P>0.05；與C組相比D組P>0.05

2.2 天麻制劑各有效成分在大鼠偏頭痛模型中對A1R表達的影響 本實驗通過免疫熒光與western blot技術檢測TG、TNC部位A1R的表達。與A組相比，B組大鼠TG、TNC中的A1R的表達明顯偏低，差異具有統計學意義(P<0.01)；與B組相比，C、D組大鼠A1R表達明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.01)，而E、F、G組大鼠A1R的表達與A組相比差異無統計學意義(P>0.05)；與C組相比，D組大鼠的A1R表達無明顯差異(P>0.05)，(見圖5～圖7、表2)。

圖5 免疫熒光檢測各組大鼠TG中A1R的表達情況(標尺均為50 μm)

圖6 免疫熒光檢測各組大鼠TNC中A1R的表達情況(標尺均為50 μm)

圖7 Western Blot檢測各組大鼠TG、TNC中A1R的表達情況(n=6，與A組相比，B組PPP>0.05；與C組相比，D組P>0.05)

表2 各組大鼠TG、TNC中A1R的表達情況

n=6，χ±s，與A組相比B組P<0.01；與B組相比C、D組P<0.01，而E、F、G組P>0.05；與C組相比D組P>0.05)

3 討 論

偏頭痛是臨床常見的原發性頭痛，其發病機制中三叉神經血管反射學說中占主導地位，神經源性炎性反應及痛覺敏化是該學說的核心部分[4]：偏頭痛發作時，激活的三叉神經血管系統產生一系列的神經源性炎性反應，導致TG釋放CGRP增多，TNC接受來自TG的信號，匯聚在丘腦腹后內側核神經元上，同時痛覺信號被傳遞到大腦皮質，從而引起典型的偏頭痛發作[5～7]。CGRP在偏頭痛中具有一定的特異性和敏感性，由三叉神經感覺傳入纖維及TNC的激活釋放，是TVS激活的生物標志物[6，8，9]。國內外研究發現偏頭痛與體內的CGRP、A1R密切相關[10，11]，A1R可通過對CGRP的抑制作用來緩解偏頭痛急性發作，其鎮痛效應十分顯著且不良反應相對較少[11]。臨床研究指出，曲坦類藥物廣泛應用于偏頭痛患者，能夠通過抑制CGRP的過度分泌，起到緩解偏頭痛的作用[12]，但因其禁用于心腦血管疾病患者，限制了其在臨床中的應用[13]。研究表明，在天麻制劑主要成分中，天麻素可以顯著地緩解偏頭痛、血管性頭痛等頑固性慢性痛[14]；香英蘭醇可對疼痛小鼠產生鎮痛作用，對羥基苯甲醇在臨床實踐中對腦神經衰弱和頭痛有效，而β-谷甾醇的藥理具有抗炎及退熱作用[15～17]。由于偏頭痛患者缺乏有效的廣泛適用的藥物治療方法，使得傳統中藥方劑(如天麻制劑)越來越受到重視。

基于神經源性炎癥反應機制而建立的ESTG模型是最常用的偏頭痛模型之一[18]，本實驗通過大鼠電刺激TG側咀嚼肌收縮及口鼻分泌物增多來評定ESTG模型制造成功，該模型主要通過電刺激引起神經源性炎性反應，與目前較為公認的三叉神經血管反射學說相契合。本實驗研究顯示，與ESTG模型組相比，舒馬普坦干預組與天麻素干預組大鼠TG、TNC中的CGRP表達明顯降低，A1R的表達明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.01)；而香英蘭醇干預組、β-谷甾醇干預組、對羥基苯甲醇干預組組與ESTG模型組之間差異無統計學意義(P>0.05)，推測天麻素可能是天麻制劑中的主要活性成分，可用于預防及改善大鼠偏頭痛發作，而香英蘭醇、β-谷甾醇、對羥基苯甲醇對偏頭痛的預防及緩解作用甚微。實驗顯示，A1R與CGRP在TG與TNC中的表達量呈負相關關系，使用天麻素治療后TVS中的A1R表達增多、CGRP表達減少，表明天麻素可以通過調節血管活性因子的表達，即激活的A1R在一定程度上降低TVS的激活，而減少TVS釋放CGRP等相關活性物質，抑制神經源性炎性反應及痛覺敏化，故在偏頭痛的治療和預防中發揮至關重要作用。實驗通過研究天麻制劑各有效成分對ESTG模型大鼠的A1R與CGRP的表達的影響，不僅證實了天麻素預防及治療偏頭痛的腺苷相關性分子機制，還有助于揭示偏頭痛的病理生理過程，也為研究天麻制劑治療偏頭痛的腺苷相關性分子機制及偏頭痛的發病機制提供實驗基礎和理論依據，隨著我們對天麻制劑的進一步深入認識和研究，天麻制劑的應用前景將會更加廣闊。