銹色粒肩天牛幼蟲的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段序列分析

葉碧歡，李海波，葉衛邦，陳友吾

（1.浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023；2.金華森林之寶農林科技開發有限公司，浙江 金華321000）

銹色粒肩天牛Apriona swainsoni隸屬于鞘翅目Coleoptera天牛科Cerambycidae溝頸天牛亞科Lamiinae白條天牛族Batocerini粒肩天牛屬Apriona[1-2]，可危害國槐Sophora japonica、黃檀Dalbergia hupehana、三叉蕨 Tectaria subtriphylla、懸鈴木Plantanus acerifoli等多種植物[3-6]，而其寄生于云實Caesalpinia decapetala樹莖的幼蟲，異名云實蛀蟲、云實蠹蟲、黃牛刺蟲、黃寮刺蟲，在民間一直都有食服的習慣，因 “一斗米換一條蟲”而得名 “斗米蟲”[7-9]。近年來，斗米蟲因其良好的藥食功效[7-8,10-11]日益獲得認同。斗米蟲野外采集困難，人工規模化生產尚未成熟，其市場價格因此逐步走高。受經濟利益驅使，目前市場上時常發生其他天牛幼蟲偽充斗米蟲的現象，導致誤食中毒等事件，擾亂藥食昆蟲市場的秩序。天牛科昆蟲分類主要依據其成蟲形態特征，幼蟲形態描述信息缺乏，幼蟲分類存在一定難度[12]。在實際工作中也發現，斗米蟲與其他天牛幼蟲，例如桑天牛A.germari幼蟲，在形態方面具有一定的相似性，僅靠幼蟲形態特征很容易鑒別錯誤。此外，因加工炮制等處理導致幼蟲形態被破壞，也提高了鑒別難度。分子生物學手段的應用在很大程度上彌補了物種形態學鑒定的不足[13-16]。線粒體細胞色素氧化酶 C 亞基Ⅰ（Cytochrome C oxidase subunitⅠ， COⅠ）[17-20]、 COⅡ[21]、 16S 核糖體 RNA（16S rRNA，16S）[22]、 ND 基因（NADH dehydrogenase subunit， ND）[23]和細胞色素B（Cytochrome b， Cytb）[24-25]等， 以及細胞核 28S核糖體 RNA（28S rRNA， 28S）[23]和核糖體 DNA 的內轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）[26-28]等多種基因已廣泛應用于多種昆蟲的分類鑒別。目前尚未發現銹色粒肩天牛幼蟲線粒體基因或核基因序列鑒定的相關報道，因此，本研究對銹色粒肩天牛幼蟲的3種線粒體編碼基因（COⅠ、COⅡ和Cytb），以及1種核糖體大亞基編碼基因（28S）共4種序列展開了研究。此次也對來自3個地區的桑天牛A.germari幼蟲樣品進行了測序，以補充桑天牛幼蟲上述4種基因的序列信息，提高天牛幼蟲進化樹拓撲結構的準確性。本研究通過多種基因片段的序列分析，為銹色粒肩天牛幼蟲的準確鑒定提供依據，也為該蟲的食藥用安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲 用于測序的4份銹色粒肩天牛幼蟲樣品分別來自于浙江金華（S1）、江西上饒（S2）、浙江開化（S3）、浙江淳安（S4），3份桑天牛幼蟲樣品分別來自于浙江金華（G1）、江西上饒（G2）、浙江開化（G3），幼蟲活體置于-4℃冰箱保存備用。

1.1.2 供試試劑 TIANamp Genomic DNA Kit，天根生物科技（北京）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒（GE0101-50）、 感受態細胞（Escherichia coli DH5α）、 TS-GelRed 核酸染料（10 000×水溶液）， 北京擎科新業生物技術有限公司；pGEM-T Easy載體，美國Promega公司；Regular Agarose，西班牙Biowest公司；50×TAE Tris-乙酸電泳緩沖液，福州Phygene生物科技有限公司。

1.1.3 供試儀器 DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；FRESCO 21微量冷凍離心機、NanoDrop 2000超微量分光光度計，美國Thermo Scientific公司；Life ECO擴增儀，杭州博日科技有限公司；DYY-12C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Bio-Rad凝膠成像系統，美國伯樂公司。

1.1.4 供試引物 所采用的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段擴增引物信息詳見表1，供試引物委托北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及濃度測定 取待提取幼蟲，用無菌水清洗數遍，濾紙吸干水分，加液氮徹底磨碎。基因組DNA的提取參照天根TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒操作說明書。利用NanoDrop 2000超微量分光光度計對樣品基因組DNA進行核酸純度及濃度的檢測，于-20℃冰箱儲藏備用。

表1 本研究供試引物信息Table 1 Information of tested primers

1.2.2 PCR擴增、電泳及測序 PCR擴增反應體系為（總體積20 μL）：2×TSINGKE Master Mix 10 μL，10 umol·L-1引物對各 1.5 uL，模板 DNA 3 uL（20 mg·L-1），ddH2O 補足至 20 μL。 擴增程序為：94 ℃預變性5 min后；94℃變性30 s，退火45 s（不同引物對的退火溫度Tm詳見表1），72℃延伸2 min，共35個循環；最后于72℃補平7 min，終止溫度為4℃。PCR擴增反應在LifeECO基因擴增儀（杭州博日）上進行。取PCR擴增產物3 μL，點樣于質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠上，TS-GelRed核酸染料染色，1×TAE緩沖液中電泳30～40 min（120 V），擴增圖譜攝取采用Bio-Rad凝膠成像分析儀。PCR擴增產物經切膠回收、純化、pGEM-Teasy載體連接、感受態細胞轉化（E.coli DH5α）和藍白斑篩選后，隨機挑選5個陽性克隆由北京擎科新業生物技術有限公司進行雙向測序。

1.2.3 數據分析 測序結果利用Contig Express軟件進行拼接，得到目的基因片段在美國國家生物信息中心（NCBI）數據庫中進行BLAST比對和相似性檢索，以確定所獲片段是否為目的基因并獲得同源序列。利用MEGA 6.0軟件將本研究獲得的基因片段與GenBank檢索獲得的同源序列進行多重比對，兩端對齊，進行序列信息分析，包括堿基組成、變異位點、簡約信息位點等。同時運用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建進化樹，模型為K2P（Kimura 2 parameter），Bootstrap置信值估算重復數設定為1 000次。

2 結果與分析

2.1 基因序列的克隆與鑒定

由表1所示：引物成功擴增獲得2種天牛幼蟲的4種基因片段。經測序、拼接并去除上下游引物及兩端不穩定序列，銹色粒肩天牛幼蟲最終的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段大小分別為817、545、434和1 088 bp，桑天牛幼蟲基因片段大小則分別為783、545、435和1 096 bp。將各基因片段在Gen-Bank進行BLAST，比對結果顯示所獲基因片段與其他天牛等昆蟲的目標基因片段的相似性達80%以上，說明本研究成功獲得2種天牛幼蟲的4種不同基因片段。

2.2 基因序列信息分析

將銹色粒肩天牛幼蟲的4種基因序列與桑天牛幼蟲序列以及GenBank中比對獲得的其他天牛同源序列進行多重比較并分析各基因序列信息（表2～4）。其中，COⅠ基因同源序列來自天牛科7屬16種，COⅡ基因同源序列來自天牛科12屬15種，Cytb基因同源序列來自天牛科3屬4種，28S基因同源序列來自天牛科7屬7種。

所有序列多重比較，兩端對齊去除冗余位點后，最終得到不同長度的各基因片段（456～744 bp），并對所有樣品4種基因序列中含有保守位點、變異性位點、簡約信息位點和單突變位點的數量及百分比進行了分析統計。表2顯示：28S的保守位點所占比例最高（73.28%），其后依次為Cytb（66.45%）、COⅠ（63.57%）和COⅡ（54.86%）；4種基因的變異率則恰好相反，COⅡ序列的變異率最高（45.14%），其后依次為 COⅠ（36.42%）和 Cytb（33.55%）， 28S變異率最低（25.34%）。

COⅠ、COⅡ、Cytb和28S各基因所比對的同源序列堿基組成特點如表3所示。其中，COⅠ、COⅡ和Cytb基因的T堿基含量最高，其次是A堿基，A+T含量（69.72%、73.81%、72.53%）均明顯高于G+C含量（30.27%、26.19%、27.47%），而28S基因的G堿基含量最高，其次是C堿基，A+T含量（38.72%）則明顯低于G+C含量（61.28%）。

表2 COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因同源序列的特殊位點分布Table 2 Distribution of specific sites of COⅠ,COⅡ,Cytb and 28S gene homologous sequences

表3 COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因同源序列堿基組成特點Table 3 Base composition characteristic of COⅠ,COⅡ,Cytb and 28S homologous sequences

COⅠ、COⅡ、Cytb和28S各基因所比對的同源序列堿基替換信息見表4。從表4可知：COⅠ、COⅡ和Cytb基因序列的顛換均高于轉換，轉換與顛換比（R）平均值約0.8，顛換以T和A之間為主；而28S基因序列R平均值為1.5，即轉換高于顛換，轉換以T和C之間為主。

表4 COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因同源序列的堿基替換模式Table 4 Base substitution mode of COⅠ,COⅡ,Cytb and 28S gene homologous sequences

2.3 基因序列的進化樹構建

分別基于COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段，運用鄰接法構建銹色粒肩天牛與其他天牛的分子進化樹（圖1A～D）。可知，基于COⅠ和28S基因序列的分子進化樹中，同屬的昆蟲均聚集為一類，其中粒肩天牛屬的銹色粒肩天牛或桑天牛同種不同樣品亦分別聚成一小分支，這與傳統的分類方法相一致（圖1A，D）。基于COⅡ和Cytb基因序列的分子進化樹中，銹色粒肩天牛和桑天牛各自不同樣品也以較高的置信值分別聚成一支，但這2種同屬的昆蟲并未如COⅠ基因序列的進化樹聚為一大類。COⅡ基因進化樹中，銹色粒肩天牛與星斑天牛屬Psacothea的黃星天牛Psacothea hilaris聚集，桑天牛則與白天牛屬Olenecamptus的六星天牛Olenecamptus clarus聚在一起。Cytb基因進化樹中，銹色粒肩天牛先與厚花天牛屬Pachyta的雙斑厚花天牛Pachyta bicuneata聚集，再與桑天牛聚類（圖1B～C）。

圖1 銹色粒肩天牛及天牛科其他昆蟲基于COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因序列的分子進化關系Figure 1 Molecular phylogenetic relationship of A.swainsoni and other insects of Cerambycidae based on COⅠ,COⅡ,Cytb and 28S gene sequences

3 結論與討論

斗米蟲等昆蟲天然保健產品因其特有的功效，逐漸被大眾熟知和接受，鑒于天牛幼蟲形態學鑒別存在的不足之處，需要依靠分子生物學手段完善以提高天牛幼蟲鑒別的準確性。相對于其他分子標記法，DNA測序在種及以上高級分類階元的分析結果更為準確直接，可作為一種有用的 “分類”輔助工具[15]。至今為止，國內外已將多種線粒體基因和核基因廣泛運用于昆蟲的系統發育、遺傳進化和物種分類等研究中[32-37]。線粒體基因嚴格遵守母系遺傳方式，進化速度適中，相對保守的同時又有足夠的變異，特別適用于解決較低階元的系統發育關系[24,38-39]，28S基因則是真核生物染色體上編碼核糖體大亞基的基因，在生物體內含量較大，在進化過程中較線粒體基因保守，尤其在高級分類階元系統發育關系研究中應用廣泛[40-41]。

本研究的3種線粒體蛋白編碼基因（COⅠ、COⅡ和Cytb）和1種核基因（28S）為昆蟲分類的常用基因。銹色粒肩天牛的上述4種基因片段及其同源序列的序列信息分析，結果表明線粒體基因（COⅠ、COⅡ和Cytb）和核基因（28S）的組成結構等存在差異。3種線粒體基因同源序列的變異率比28S基因片段高，這與核基因較線粒體基因更為保守這一觀點相符合[40]。此外，3種線粒體基因同源序列表現出A和T堿基偏倚，顛換高于轉換，而28S同源序列則相反（G和C堿基偏倚且轉換高于顛換）。此次所選擇分析的銹色粒肩天牛28S基因及其同源序列的堿基偏倚性與其他研究報道的天牛科28S基因相同，其堿基組成特點也與 28S rDNA 相符合[40]。

不同物種，其分子分類適用的基因也存在差異，根據不同物種選擇合適的基因十分關鍵。CHEN等[39]以大蚜亞科Lachninae為研究對象，評估了3種線粒體基因（COⅠ、COⅡ和Cytb）作為DNA條形碼的有效性，發現COⅡ基因較其他兩者更合適于不同大蚜的鑒定，Cytb因其序列多樣性高，是蚜蟲種群遺傳學研究的有效標記。楊晉英[38]研究表明：COⅠ、COⅡ和Cytb基因適用于五倍子蚜分類，其分子聚類關系與形態學分類相一致。李成等[42]研究表明：28S非常適合于旋毛蟲Trichinella spiralis的分類鑒定及其分子進化關系的研究。本研究顯示：利用COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因的通用性引物均能有效地擴增銹色粒肩天牛和桑天牛幼蟲的目的片段。基于這4種基因序列構建的進化樹亦都能以較高的置信值將銹色粒肩天牛幼蟲單獨聚成一支，與其他種的天牛區分開來，表明上述4種基因均可作為快速鑒別銹色粒肩天牛幼蟲與桑天牛等其他天牛幼蟲的分子參考依據。

總體而言，COⅠ、COⅡ、Cytb和28S這4種基因的進化樹拓撲結構與傳統分類結果基本相一致，但COⅡ和Cytb基因進化樹其屬級別的聚類稍有差別，其原因可能是本研究涉及的COⅡ和Cytb序列僅是該基因的部分序列，其所覆蓋的信息還不夠充足，可通過增加昆蟲的目標基因序列數量或長度，以獲得更為理想的系統進化樹。