電針聯合康復訓練對急性骨骼肌損傷大鼠nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白表達的影響*

于 楊,郭文海,高藝書,韓玉生△

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

骨骼肌損傷好發于四肌與臀部，以鈍挫傷或牽拉傷為主，外力的直接或間接作用引起肌纖維受到過度的壓力和牽拉，造成骨骼肌纖維斷裂，引起組織炎癥、水腫、變性和壞死等病理改變[1]。骨骼肌損傷后容易形成瘢痕修復，愈合所需時間長且極易導致再次損傷，骨骼肌損傷后再生修復研究成為國內外熱點[2]。本研究觀察電針聯合康復訓練對急性骨骼肌損傷模型大鼠神經肌肉接頭相關蛋白nestin、Cdk5和ε-nAChR動態表達的影響，探討其對骨骼肌損傷修復的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠，體質量(250±20)g，動物合格證號SCXK(魯)20140001，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。在清潔級實驗室中正常喂養，室溫(24±2)℃，濕度55%～60%。

1.2 主要試劑及儀器

蛋白質抽提試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自賽諾博公司；nestin、Cdk5和ε-nAChR一抗購自CST公司；GAPDH抗體、HRP標記山羊抗小鼠/兔IgG、標準蛋白 marker等均購自武漢博士德生物工程有限公司。

2135型組織切片機(德國菜卡)；Moticam3000顯微攝影成像系統(美國Motic)；低溫高速離心機(科大創新);電泳儀、垂直電泳槽、轉移槽(北京六一儀器廠)；ThermoForma725(美國Forma公司)；凝膠成像系統(以色列MiniLumi公司)。

1.3 大鼠急性骨骼肌損傷模型制備

參考文獻[3-4]，大鼠稱重后用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，右后肢用脫毛劑脫毛，大鼠俯臥右后肢外展且膝關節呈90°屈曲，固定充分暴露腓腸肌。打擊器鋼球重量200 g，下落高度100 cm，打擊部位腓腸肌中段面積1 cm2。造模后觀察打擊部位皮膚完整無破損，脛腓骨未發現骨折，局部組織出現腫脹等急性骨骼肌閉合性性損傷表現則為成功。

1.4 分組及干預方法

模型制備成功的大鼠隨機分為模型組與干預組，每組12只，再隨機分為7天與14天兩個時間點，每個時間點6只，另取6只大鼠為正常組。造模成功后，大鼠立即進行制動和冷敷5 min，2天后開始進行相應干預。

干預組大鼠先進行跑臺訓練，跑臺速度15 m/min，時間15min，每日1次。跑臺訓練后進行電針干預，參照實驗動物穴位圖譜[5-6]，大鼠固定后取局部損傷部位阿是穴、承山穴及承筋穴，局部常規消毒，使用0.25 mm×25 mm針灸針，針刺深度0.5 mm，連接電針儀，取疏密波，頻率2 Hz，強度0.4 mA，持續20 min，每日針灸1次。連續干預6天后休息1天。正常組與模型組不做任何處理。

1.5 檢測指標

1.5.1 骨骼肌HE染色 在干預7天、14天于末次針刺30 min后，麻醉大鼠，取出損傷部位的腓腸肌浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。經常規石蠟包埋后，進行切片，HE染色，Motic3000顯微攝影系統在400倍鏡下進行拍照，觀察骨骼肌病理學變化。

1.5.2 WB法檢測大鼠骨骼肌nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白表達 取液氮凍存的腓腸肌組織0.5 g放入預冷瓷研缽中,研磨成極細的粉末，用蛋白抽提試劑抽提出蛋白，經BCA法蛋白定量后調整蛋白濃度，按WB步驟檢測nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白，上樣量為20 μg/孔，一抗濃度均為1∶500，二抗濃度1∶2 000。采用凝膠成像系統進行分析, 以目的蛋白與對照蛋白光密度的比值作為目的蛋白的相對蛋白表達量。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 各組大鼠骨骼肌病理變化

HE染色顯示,正常組大鼠骨骼肌纖維形態規整，肌細胞染色清晰，無斷裂、水腫和融解，未見充血和炎細胞浸潤。模型組7天時可見肌纖維斷裂，肌細胞腫脹融合，大量充血，炎癥細胞浸潤；14 h可見炎癥細胞浸潤明顯增加，結締組織增生明顯，局部可見肌纖維壞死區。與模型組相比較，干預組7天、14天時肌纖維排列較規整，炎細胞明顯減少，結締組織增生和壞死區明顯減少，新生肌纖維逐漸增多。見圖1。

2.2 各組大鼠骨骼肌中nestin蛋白的表達

與正常組比較，模型組及干預組大鼠骨骼肌中nestin蛋白表達帶明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，干預組大鼠骨骼肌中nestin蛋白表達明顯增加(P<0.05)。模型組和干預組7天時nestin蛋白表達明顯高于14天，呈下降趨勢。見表1、圖2。

表1 各組大鼠骨骼肌中nestin蛋白表達水平

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白的表達

與正常組比較，模型組及干預組大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表達帶明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，干預組大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表達明顯減少(P<0.05)。模型組和干預組7天時Cdk5蛋白表達明顯高于14天，呈下降趨勢。見表2、圖2。

表2 各組大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表達水平

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

2.4 各組大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白的表達

與正常組比較，模型組及干預組大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表達帶明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，干預組大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表達明顯增加(P<0.05)。模型組和干預組7天時ε-nAChR蛋白表達明顯低于14天，呈上升趨勢。見表3、圖2。

表3 各組大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表達水平

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

注:A.正常組,B.模型組7 d,C.模型組14 d,D.干預組7 d,E.干預組14 d。圖2 各組各時間點大鼠骨骼肌蛋白表達

3 討論

中醫學認為急性骨骼肌損傷屬于“筋傷”范疇，鈍挫或牽拉等外力導致局部經脈受損、氣機失利是其重要病理因素。早在《黃帝內經》中就有關于針刺治療筋傷的記載：“一針皮，二針肉，三針脈，四針筋”。研究表明電針能促進骨骼肌損傷的修復進程[7]。跑臺訓練能夠提高NADH 還原酶蛋白表達，激活肌衛星細胞來促進損傷骨骼肌的修復[8]；電針聯合跑臺訓練能夠更好地抑制瘢痕組織的形成，增加Agrin 蛋白表達，加速ACh受體聚合，從而促進骨骼肌損傷后NMJ 的重建[4,9]。

骨骼肌損傷后機體會啟動自我再生修復機制，增殖的成纖維細胞所形成的瘢痕組織阻礙周圍神經對肌纖維的支配作用，造成骨骼肌電生理傳導功能障礙。神經肌肉接頭(Neuromuscular junction,NMJ)是完成運動神經與骨骼肌信號傳導的重要結構和功能單位，NMJ功能的完整對電生理信號傳導和實現神經對肌肉的支配具有重要意義[10]。分布于NMJ突觸后膜上的ε-nAChR特異性的表達于成熟的肌纖維中，能在極短時間內結合大量Ach，引發神經肌肉的電生理傳導，被認為是NMJ損傷后電生理功能恢復的關鍵蛋白[11]。電生理信號傳導與NMJ周圍ACh受體簇集密切相關，ACh能通過nestin與Cdk5來抑制NMJ處ACh受體的簇集[12]，敲除Cdk5或nestin后Ach對其受體的解散作用被抑制，使細胞膜上的Ach受體大量表達；Cdk5或nestin過表達時，Ach對其受體的解散作用也增強，使Ach受體的表達相對減少[13]。

本實驗結果中，急性骨骼肌損傷大鼠ε-nAChR蛋白表達量明顯低于正常組，表明急性損傷對骨骼肌肉中ε-nAChR的表達有明顯抑制作用。干預組不同時間點ε-nAChR蛋白表達量逐漸升高，可能是電針聯合康復訓練促進了損傷區域生成新的骨骼肌細胞，從而進一步生成大量的乙酰膽堿受體，促進NMJ電生理功能的恢復。急性損傷后大鼠骨骼肌中Cdk5和nestin蛋白表達均明顯增加，電針聯合康復訓練后nestin蛋白在7天、14天表達量均高于同時間點的模型組，而Cdk5蛋白表達逐漸降低。表明急性骨骼肌損傷能夠誘導Cdk5和nestin蛋白的表達，電針聯合康復訓練能促進骨骼肌中nestin蛋白的表達，抑制Cdk5蛋白的表達。

綜上所述，電針阿是穴、承山穴和承筋穴，同時配合一定量的跑臺康復訓練能夠通過抑制骨骼肌Cdk5蛋白表達，上調nestin和ε-nAChR蛋白表達，促進神經肌肉接頭電生理功能的修復，從而改善大鼠骨骼肌急性損傷，表明電針聯合康復訓練對急性骨骼肌損傷是一種有效的干預手段。