“標本配穴”電針對慢性心肌缺血模型大鼠線粒體結構及呼吸酶活性的影響*

嚴江天，陳 茜，李 丹，馬劼旎，謝 俊，吳 松,2△

(1.湖北中醫藥大學,湖北 武漢 430061; 2.針灸治未病湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430061)

心肌缺血指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態。隨著人民生活水平的提高和我國人口不斷老年化，心肌缺血在我國的患病率呈逐年上升的趨勢，因此，防治心肌缺血已成為醫學研究的重點和熱點之一。心肌缺血的發病機制目前還未有定論，但多數研究人員認為自由基生成增加、Ca2+超載、細胞凋亡、中性粒細胞浸潤等均參與其發生，而這些環節均與心肌線粒體結構功能障礙有關[1]。線粒體是為機體提供所需的能量ATP的重要細胞器，當心肌組織發生缺血缺氧損傷時，會影響線粒體的功能，甚至破壞線粒體的結構[2]。本實驗在前期實驗的基礎上[2-4]，以大鼠線粒體為切入點，觀察標本配穴電針對慢性心肌缺血大鼠心肌3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehy de-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、檸檬酸合酶(Citrate synthase，CS)、細胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase，CCO)酶活性及線粒體結構變化的影響，并探討其治療慢性心肌缺血的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

本實驗選用3月齡、體質量為180～220 g的SPF級Wistar雄性健康大鼠30只，購于湖北省醫學科學研究實驗動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。依照隨機數字表將大鼠隨機分入3組：空白組、模型組、標本配穴組，每組10只。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 752型分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；Finesse 325旋轉石蠟切片機(美國賽默飛世爾科技有限公司)；AWL-1001-M艾科浦超純水機(美國艾科浦國際有限公司)。

1.2.2 試劑 ATP含量測試盒(南京建成生物工程研究所);3-磷酸甘油醛脫氫酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);檸檬酸合酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ(細胞色素C氧化酶)活性測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);鹽酸異丙腎上腺素(Isoprenaline Hydrochloride，ISO)(Sigma-Aldrich Co. LLC)。

1.3 模型建立與處置方法

參考文獻[5-6]制備實驗大鼠心肌缺血模型，適應喂養3天后，于實驗大鼠背部皮下注射ISO(5 mL/kg)，連續7日，以心電圖S-T段抬高振幅≥0.1 mV視為造模成功[7-8]。適應性喂養3天后，空白組：連續7天行皮下注射0.9%氯化鈉溶液(5 mL/kg)；模型組：連續7天行皮下注射ISO；標本配穴組：連續7天在進行電針干預后注射ISO，7日后每日給予電針干預，連續21天。標本配穴組電針參照《大鼠穴位圖譜的研制》[9]取雙側“足三里”、雙側“關元”及雙側“內關”“足三里”直刺深約5 mm，“內關”直刺深約5 mm，“關元”直刺深約3 mm。接HANS-200電針治療儀，同側“足三里”“內關”組成一對接通電極，共配成2組電極。選用疏密波，頻率2～100 Hz，電流強度1 mA，每日1次，1次10 min。

1.4 觀察指標

1.4.1 心肌超微結構 各組大鼠于實驗第25天，以10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，開胸摘取心臟，用4℃冷生理鹽水迅速沖洗心臟組織。橫斷面切取心臟中下1/4組織，置于2.5%的戊二醛溶液固定，丙酮梯度脫水,包埋，聚合，切片，將制備好的樣品放入透射電鏡觀察檢查，釆集圖像。

1.4.2 心肌組織ATP含量、GAPDH、CS和心肌線粒體CCO活性測定 各組大鼠于實驗第25天，以10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，開胸摘取心臟,用4℃冷生理鹽水迅速沖洗心臟組織，稱取、勻漿、離心后按照試劑盒說明書步驟操作檢測心肌組織中ATP的含量、心肌線粒體CCO活性、心肌組織中CS及GAPDH活性。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 心肌超微結構

由圖1可知,空白組大鼠心肌細胞心肌纖維排列整齊，線粒體比較豐富且結構完整，嵴結構有序，邊界較清，形態大小一致。模型組心肌損傷嚴重，心肌細胞排列松散混亂，部分線粒體膜破裂、膜結構消失；線粒體數量減少，明顯腫脹，嵴結構模糊、排列紊亂、數量變少，部分線粒體出現嵴斷裂，甚至空泡化。標本配穴組損傷程度較模型組明顯改善，大部分心肌纖維排列基本整齊，橫紋清晰，線粒體結構基本完整，部分線粒體輕微水腫，空泡化減少。

2.2 心肌組織ATP含量、GAPDH、CS和心肌線粒體CCO活性比較

與空白組比較，模型組、標本配穴組心肌組織ATP含量、心肌組織GAPDH、心肌組織CS和心肌線粒體CCO活性均明顯降低(P<0.01)。但與模型組比較，標本配穴組4項指標均顯著增高(P<0.01)。見表1。

圖1 各組大鼠心肌線粒體超微結構(15 000×)

表1 各組大鼠心肌組織ATP含量、GAPDH、CS和心肌線粒體CCO活性比較

注：與空白組比較,#P<0.01；與模型組相比較,△P<0.01。

2.3 心肌組織ATP含量、GAPDH、CS和心肌線粒體CCO活性相關與回歸分析

經直線相關回歸分析，心肌組織GAPDH活性與心肌組織ATP含量呈正相關(r=0.942，P<0.01)，心肌組織CS活性與心肌組織ATP含量呈正相關(r=0.908，P<0.01)，心肌線粒體CCO活性與心肌組織ATP含量呈正相關(r=0.949，P<0.01)。見圖2～4。

圖2 ATP-GAPDH散點圖

圖3 ATP-CS散點圖

圖4 ATP-CCO散點圖

3 討論

線粒體是細胞生命活動過程中極為重要的細胞器，是細胞有氧呼吸和合成ATP的主要場所。細胞生命活動所需能量的95%均來自線粒體，因此被稱為細胞生命活動的“供能中心”。生理活動旺盛的細胞內線粒體含量較生理活動不旺盛的細胞更豐富。心臟作為維持人體正常生命的重要器官，對能量的需求非常大，因此心肌細胞中線粒體的含量也較其他組織豐富，研究表明線粒體占心肌細胞總體積的40%～45%[3]。當心肌細胞處于缺血狀態時，線粒體功能受到影響，形態結構同時被破壞[10]。同時，心肌細胞有氧呼吸產生的ATP為心臟提供正常生命活動所需的能量，以維持心肌細胞的舒縮功能和離子泵功能。有氧呼吸的過程主要分為3個階段：糖酵解、三羧酸循環與氧化磷酸化，而GAPDH、CS、CCO分別是這3個階段的關鍵酶，與細胞正常進行有氧呼吸并產生能量有著密不可分的關系。GAPDH作為糖酵解途徑中的1個關鍵酶，參與催化糖酵解的中樞環節，主要催化3-磷酸甘油醛氧化磷酸化為甘油酸-1,3-二磷酸[11]，葡萄糖在其作用下分解并產生為機體提供能量部分的ATP，且具有參與細胞自噬的作用[12-13]；CS催化三羧酸循環(TCA cycle)的第一個反應，被認為是TCA循環的限速酶[14]，催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合生成檸檬酸和輔酶A[15]，因此其活性影響線粒體整個氧化代謝的過程；位于電子傳遞鏈尾端的CCO作為呼吸鏈中的關鍵氧化酶，其活性是線粒體能量代謝障礙的內源性指標，能反映線粒體內膜呼吸鏈功能的完整性和心肌細胞代謝的興衰[16-18]，并調控能量的代謝。因此心肌組織GADPH、CS、CCO的活性可以反映心肌細胞組織結構完整程度和有氧呼吸的功能強弱，從而推斷心臟能量的供給和反映心臟功能的盛衰。本實驗通過觀察心肌線粒體結構及GAPDH、CS、CCO活性的變化，可以更直觀的反映出各組大鼠心肌線粒體的變化，分析心肌線粒體的受損程度，從而觀察標本配穴電針干預對心肌線粒體缺血后的保護作用。

本實驗采用“以中醫治未病為指導思想，雙固一通為核心”的標本配穴法，以固護正氣的腧穴為本，以祛除邪氣的腧穴為標，兩者配合應用的腧穴配伍。標本配穴法既能鼓舞機體正氣，又能提高機體抵御病邪的能力；既能夠針對病邪對病變組織進行局部治療，又能鞏固正氣對機體整體進行調節；既體現了“治未病”思想，又將局部效應與整體效應完美結合。本實驗選取補益先天之精的關元與固護后天之氣的足三里，配以活血通絡、寧心安神的內關，關元可培腎固本、補益精血、調理沖任，扶助人體先天之本；足三里為三焦之氣所生處，為補益元氣、調和氣血、補虛強壯之要穴；內關穴為手厥陰心包經的絡穴，自古以來是防治心胸部疾患的有效之穴，研究表明，針刺內關穴能通過多個通路、靶點對心臟起到保護及修復作用[19-20]。三穴同用，固本祛邪、標本兼治，起到保護心臟功能的作用，防止病情惡化，促進患者康復。

本研究結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠心肌線粒體結構遭到嚴重破壞，心肌組織ATP含量、心肌組織GAPDH、心肌組織CS和心肌線粒體CCO活性均明顯降低。與模型組相比，標本配穴組線粒體結構基本完整，較模型組損傷明顯降低，心肌組織ATP含量、心肌組織GAPDH、心肌組織CS和心肌線粒體CCO活性也較模型組顯著升高。研究說明，標本配穴電針可提升線粒體呼吸酶活性，增加有氧呼吸產能效率，改善心臟能量代謝，從而減輕心肌細胞的結構破壞，對心肌組織起到保護作用，為臨床上治療心肌缺血提供新的配穴思路。