調心安神針法預處理對缺血再灌注性心律失常兔心肌細胞凋亡的影響*

王 銳，郭 麗，崔華峰，李永春，王長春，李明妍，徐 敏

(1.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南250011；2.山東中醫藥大學,山東 濟南 250355)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是一種常見的臨床現象，可引起心肌組織結構、功能異常、大量細胞凋亡甚至心律失常的發生[1]，尤其是室性心律失常。據報道，心梗后溶栓或支架植入后，室性心律失常發生率可達80%[2]，是再灌注后猝死的主要原因。筆者基于多年臨床經驗，以靈臺、神道、內關、百會穴組成調心安神方，并施行特定的操作手法，治療早搏取得較好的療效[3]。前期研究發現，該針法可減少室性心律失常模型兔心肌細胞損傷，明顯縮短室性心律失常持續時間[4]。在此基礎上，筆者采用結扎/松解兔左冠狀動脈前降支的方法制作RA模型兔，觀察調心安神針法預處理對RA模型兔心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

健康家兔40只，雌雄各半，體質量1.5～2.0 kg，濟南西嶺角生物科技有限公司提供[動物合格證號：SCXK(魯)20150001]。免疫組化一抗：兔抗Bcl-2和兔抗Bax(proteintech公司，貨號分別為12789-1-AP、50599-2-Ig)；廣譜二抗(上海長島生物技術有限公司，貨號D-3004);RIPA組織細胞快速裂解液(上海基爾頓生物科技有限公司，貨號BYL40825)；BCA蛋白定量試劑盒(thermo公司，貨號PICPI23223);Western印跡法檢測一抗：活性Caspase-3抗體(Abcam公司，貨號Ab2302)；GAPDH抗體(CST公司，貨號#5174)；羊抗兔HRP標記二抗(碧云天生物技術有限公司，貨號A0208)。

1.2 分組及建模

40只家兔隨機分為假手術組、模型組、針刺組、胺碘酮組，每組10只。

再灌注性心律失常模型復制參照Reffelmann的方法。兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉，呼吸機導管連接氣管插管給予機械通氣，呼吸頻率30 r/min，吸呼比1∶1.5，通氣流量根據肺膨脹大小調整。開胸，左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿線、結扎，立即監測心電圖Ⅱ導聯T波、ST段變化，以左室前壁發紺及心電圖ST段抬高≥0.5 mV為缺血標志。結扎40 min后松開硅膠管，恢復灌流60 min，抬高的ST段相對降低(>50%)，缺血區域心外膜顏色恢復紅潤。連續記錄心電圖至手術完畢，取缺血區中央部位心內膜心肌。

假手術組：穿線不結扎，靜置100 min。針刺組：造模7天前開始給予調心安神針法預治療，每天1次，共7天。針刺組和模型組第8天造模取材。胺碘酮組：于再灌注即刻泵入胺碘酮(3 mg/kg溶于生理鹽水5 mL中)，5 min泵入完畢。

1.3 針刺方法

參照中國針灸學會實驗針灸專業委員會制訂的“動物針灸穴位圖譜”取穴。靈臺、神道均向上斜刺5 mm，用震顫法快速小幅度行針1 min后起針；百會穴向后平刺5 mm；雙側內關穴分別直刺5 mm，行針1 min后接電針治療儀，疏密波，刺激強度以家兔上肢出現輕微顫動為度。百會、內關留針20 min。

1.4 觀察指標

1.4.1 Bcl-2、Bax蛋白檢測 將采集的心肌組織立即置于液氮停留約30 s使組織立即降溫、凍結，裝入自封袋中保存于-80℃冰箱。切片前將組織樣本置于-20℃冰箱內復溫30 min，用OTC包埋膠包埋組織，置于冷凍切片機上，凍結后切片，切片厚度5～7 μm，1張用于HE 染色，2張用于免疫組化染色。于光學顯微鏡下400倍放大拍照, 顯微圖像分析系統分析陽性表達面積。

1.4.2 活性Caspase-3檢測 將心肌組織剪成細小的碎片，加入裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解，4℃ 12 000 g離心15 min，取上清進行蛋白質定量，并據此進行PAGE膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，稀釋一抗抗體(活性Caspase-3 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000)，和膜室溫孵育2 h。TBST洗滌3次，1∶1 000稀釋HRP標記的二抗，與膜37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL發光液顯色，以Tanon-5200成像系統進行掃描分析。以GAPDH作為內參。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色

假手術組：心肌組織結構正常，無異常形態學改變;模型組：心肌組織可見明顯損傷，細胞排列紊亂、連接疏松。針刺組與胺碘酮組：心肌損傷較輕，部分心肌排列紊亂,細胞間輕度疏松溶解,可見較多炎性細胞聚集；炎性細胞明顯減少。見圖1。

圖1 各組HE染色

2.2 Bcl-2、Bax蛋白表達比較

結果顯示，模型組Bcl-2蛋白表達最低，假手術組最高，針刺組、胺碘酮組均較模型組明顯升高(P<0.01)，針刺組較胺碘酮組低(P<0.05)；模型組Bax蛋白表達最高，假手術組最低，針刺組、胺碘酮組均較模型組明顯降低(P<0.01)，針刺組與胺碘酮組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、封三彩圖2～3。

表1 各組Bcl-2、Bax蛋白陽性表達面積比較

注：與模型組比較，△P<0.01；與假手術組比較，☆P<0.01；與胺碘酮組比較，※P<0.05，◎P>0.05。

2.3 活性Caspase-3表達比較

結果表明，模型組活性Caspase-3表達最高，假手術組最低，針刺組、胺碘酮組均較模型組明顯降低(P<0.01)，胺碘酮組較針刺組低(P<0.01)。見表2、圖4。

表2 各組活性Caspase-3表達比較

注：與模型組比較，△P<0.01；與假手術組比較，☆P<0.01；與胺碘酮組比較，※P<0.01。

圖4 各組活性Caspase-3表達比較

3 討論

RA是缺血心肌再灌注后引起的損傷，與氧自由基、細胞間耦聯、鈣離子、自主神經及體液系統等多種因素相關[5]。在心肌缺血再灌注損傷的發生過程中，細胞凋亡對心肌細胞的結構與功能損害起著非常重要的作用。因此，抑制心肌細胞凋亡的干預因素，能夠減輕心肌缺血再灌注損傷[6]。

MIRI中細胞發生凋亡的機制主要包括氧化損傷、影響線粒體功能和能量代謝、鈣穩態失衡等[7]，Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白酶家族在線粒體途徑中起著關鍵作用。其中，Bcl-2 是重要的細胞凋亡抑制因子，Bax是重要的細胞凋亡促進因子，二者相互作用調控細胞凋亡過程，通過改變線粒體膜的通透性和調控細胞色素C的釋放，激活下游的半胱氨酸蛋白酶家族而誘導凋亡[8]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要效應因子，能滅活諸多修復程序及抑制凋亡因子，是細胞凋亡級聯反應的最后執行者。有研究證實,急性心梗患者血清Caspase-3較健康人群顯著升高，對于AMI患者的診斷和預后有一定的臨床價值[9]。

免疫組化染色Bcl-2 和 Bax的陽性表達在細胞漿胞內見為棕黃色區域。本研究中假手術組心肌細胞Bcl-2蛋白表達較多，而Bax和Caspase-3蛋白表達較少。RA發生后Bcl-2蛋白表達明顯減少，而Bax、Caspase-3蛋白表達明顯增加，進一步證實了細胞凋亡參與缺血再灌注損傷過程。

胺碘酮為一種常用的高效抗心律失常藥物，可降低竇房結、浦肯野纖維的自律性和傳導性，有拮抗兔缺血再灌注心肌細胞凋亡的作用[10]。本研究顯示，調心安神針法預處理和胺碘酮干預后，RA模型兔心肌細胞Bcl-2蛋白表達增加，Bax 、Caspase-3蛋白表達減少，表明二者對于心肌細胞凋亡具有明顯的抑制作用，且胺碘酮作用較調心安神針法更為顯著。

靈臺、神道穴均屬督脈，分別位于第6、5胸椎棘突下。《會元針灸學》曰：“靈臺者,……其兩旁為督脈之所系，陽氣通其中，心靈居上，故名靈臺?！薄督浹ㄡ屃x匯解》中記載：“……為心氣之通道，主心疾，故名神道?！鼻叶矫}有一條分支入心中，故位于上焦處的靈臺、神道穴可以治療心臟疾患?，F代研究表明，背俞穴的分布規律與脊神經節段性分布特點大致吻合。督脈穴、夾脊穴、背俞穴均位于背俞功能帶上，受相同神經支配的各穴治療作用及作用機制大體相同[11]。認為靈臺、神道穴對于早搏有相對特異性的治療作用[3]，在調心安神針法中要求兩穴的操作須力求使針感向前胸或側胸部放散，即“氣至病所”。這種操作作用于軀體感覺神經末梢及交感神經末梢，通過神經的軸突反射、節段反射途徑作用于脊髓相應節段的植物神經中樞，以調整心臟功能[11]。內關屬手厥陰心包經，為八脈交會穴之一，通于陰維脈，有寧心安神、鎮靜定痛、理氣和胃的作用，四總穴歌有“心胸內關謀”之說。研究表明，針刺內關可增加心肌組織灌流量，改善末梢循環，糾正由于心肌缺血而誘發的心律失常[12]，減少了后除極電位和心律不齊的發生率[13]。而且，針刺內關穴可促進氧自由基清除[14]、減少細胞內Ca2+超載[15]、調節細胞自噬[16]、誘導保護性蛋白[17]等，從而達到對心肌細胞的保護。百會為“五臟六腑奇經之陽，百脈之所會”，具升陽舉陷、益氣補虛之力，可交通陰陽、調節全身氣機[18]。《針灸大成》載百會穴：“主頭風中風……心煩悶，驚悸健忘，忘前失后，心神恍惚，無心力……百病皆治?！薄叭松碛兴难ㄗ顟薄贂w其一也”，百會還是內科急救常用穴之一。

綜上所述，調心安神針法通過上調Bcl-2蛋白表達、下調Bax 、Caspase-3蛋白表達，抑制心肌細胞凋亡，從而減輕缺血再灌注過程對心肌的損害，與以往的研究是一致的[19-20]，但具體機制還需進一步深入研究。