碳點-金納米簇結合的雙發射熒光探針的制備及傳感應用

張曉音，余莉萍

(天津大學理學院，天津 300350)

近年來，熒光納米材料因具有優越的穩定性、較高的靈敏度以及低的背景信號等優點受到了廣大研究人員的關注[1]。其中，碳點因具有熒光量子產率高、細胞毒性低以及制備條件溫和的優點而成為最受歡迎的熒光納米材料之一[2-4]。各種改性碳點不僅可以響應Fe3+和Hg2+等金屬離子，還可以和其他金屬納米顆粒結合用于識別非金屬物質如谷胱甘肽等[5-7]。此外，金納米簇由于具有尺寸小、毒性低、生物相容性好以及發射光譜可調等優點也引起了科研者的極大興趣，被廣泛應用于生物傳感、成像和催化等[8-10]。

在熒光傳感分析應用中，由于單個熒光信號很容易受到實驗條件如溫度、儀器條件、探針濃度以及溶劑極性等的影響，所以單一響應的材料已經不能滿足各類傳感應用的需求，發展新型多元復合納米熒光材料成為該領域的一個研究方向。已有研究報道表明基于雙發射的熒光探針受外界環境影響較小，可以排除單個熒光探針中的一些不利條件，從而實現更優越的檢測性能[11-16]。如：采用碳點和金納米簇結合的雙發射熒光探針檢測Hg2+，得到了比單一模式探針更高的靈敏度和更低的檢出限[11-12]；量子點與金納米簇結合探針對Pb2+具有很高的靈敏度，能用于自來水、礦泉水等實際水樣中Pb2+的檢測[13]；“開-關-開”模式的碳點和金納米簇復合探針能選擇性檢測水中Cd2+和血清中的抗壞血酸[14]。這些研究結果都表明復合納米熒光探針具有更高的穩定性、選擇性和可靠性等優點，有很大的潛在應用價值。

本研究先采用水熱法制備碳點，再以含硫超支化聚合物作為模板和還原劑對氯金酸進行還原制備金納米簇，然后對碳點-金納米簇結合的雙發射熒光探針的光譜性質、穩定性進行了考察，實現了對四環素類藥物的傳感應用。

1 實驗部分

1.1 藥品與儀器

實驗試劑：超支化聚乙烯亞胺(PEI，MW=1 800)，阿法埃莎(中國)化學有限公司；檸檬酸，天津科威公司；氯金酸(HAuCl4)，北京索萊寶科技有限公司；四環素類藥物(TCs)，北京華威銳科化工有限公司。以上試劑以及實驗中所用其它試劑均為分析純，直接使用。

實驗儀器：電子天平(BT-125D，德國賽多利斯科學儀器有限公司)； pH計(FE20K，德國梅特勒-托利多公司)；數控超聲波清洗器(KQ2200，昆山市超聲儀器有限公司)；電熱真空干燥箱(DZG-4018，天津市天宇實驗儀器有限公司)；循環水多用真空泵(SHZ-D(III)，鞏義市瑞德儀器設備有限公司)；紫外-可見分光光度計(T6，北京普析通用儀器有限公司)；熒光分光光度計(Cary Eclipse，美國瓦里安公司)；透射電子顯微鏡(TF20，FEI)。

碳點原液和金納米簇原液用pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液分別稀釋2 000倍和60倍，然后以V(CD)∶V(AuNCs)=1∶9的比例將金納米簇加入到碳點中，超聲5 min，得到雙發射CD-AuNCs熒光探針。

首先考察了不同濃度TC對CD-AuNCs的熒光強度的影響，發現TC對CD和AuNCs的熒光都有猝滅作用[圖4a)]，且碳點和金納米簇的熒光強度比值(FCD/FAuNCs)與一定濃度范圍內的TC濃度呈線性關系。在1.9×10-4～5.2×10-2g/L濃度范圍內，以FCD/FAuNCs對TC濃度作線性關系圖[圖4b)]，得到線性方程FCD/FAuNCs=2.54812-17.22774c，R=0.99。

1.2 碳點(CD)的制備

考察pH值對CD-AuNCs體系熒光強度的影響時我們發現：在pH 值為2～10范圍內，AuNCs的熒光強度幾乎不受pH值的影響，但CD的熒光強度隨著pH值的增大先增強后降低，在pH=6時達到最大，CD-AuNCs的熒光強度也在pH=6達到最強(圖3)。通常情況下，pH值對可離子化的熒光物質的熒光強度影響很大。因為碳點表面有大量的羧基基團，在酸性條件下羧基電離發生較大變化，所以CD的熒光強度受pH值影響較大[19]；而AuNCs表面沒有離子，所以其熒光強度受pH值影響較小。后續的實驗測試均在pH=6的條件下進行。

1.3 金納米簇(AuNCs)的制備

實驗條件同1.5，考察非四環素類藥物紅霉素(ERY)、鏈霉素(STR)、氯霉素(CL)、青霉素(PEN)、頭孢曲松鈉(CRO)和磺胺甲基嘧啶(SUL)對CD-AuNCs熒光強度的影響。

1.4 pH值對CD-AuNCs熒光強度的影響

配制pH值2～10的醋酸-醋酸鈉溶液。用不同pH值的溶液將AuNCs原液稀釋10倍，碳點稀釋2 000倍，再以V(CD)∶V(AuNCs)=3∶4的比例混合。在激發波長為370 nm，狹縫為10 nm的條件下測試CD-AuNCs體系的熒光強度。

1.5 CD-AuNCs對四環素類藥物(TCs)的傳感分析

“說來說去,我看你是成心不想給我面子!”楊秉奎有點生氣,轉身對周萍說:“咱不跟他瞎耽誤工夫了,我給你找個更好的連隊!”

取CD-AuNCs溶液2 mL于離心管中，加入0.5 mL緩沖溶液，超聲使其混合均勻，然后加入相同體積、相同濃度的四環素(TC)、金霉素(CTE)、地美霉素(DEM)、多西霉素(DOX)和土霉素(OXY)溶液，在370 nm激發波長，狹縫10 nm條件下進行熒光測試。

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1.6 CD-AuNCs對TCs的選擇性考察

采用乙?；虺Щ埘０?胺[HPA(S)-Ac]作為模板和還原劑制備金納米簇(AuNCs)[18]：將聚合物HPA(S)-Ac配置成5 g/L 的水溶液，用1 mol/L的NaOH溶液將20 mmol/L的HAuCl4水溶液調至pH值為5.8。在80 ℃水浴中，按照V(HAuCl4)∶V[HPA(S)-Ac]為3∶10的比例將HAuCl4溶液邊攪拌邊緩慢滴加到HPA(S)-Ac溶液中。待溶液充分混勻后，將其靜置于80 ℃的電熱真空干燥箱中反應20 h，得到黃色溶液，用0.22 μm的水膜過濾得到純化的AuNCs溶液，將其存放于4 ℃冰箱中避光備用。

2 結果與討論

2.1 CD、AuNCs以及CD-AuNCs的光譜性質

建設工程中經常出現交叉施工的現象，這在建設生產過程中是普遍存在的現象。在建設過程中，為了節省施工時間，經常會出現不按施工規定流程的流程進行規范操作的現象。如鋼筋結構綁的不夠結實，物體存放和使用不規范等等，都有可能對施工人員自身和他人帶來安全威脅。

圖1 CD、AuNCs和CD-AuNCs的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of CD, AuNCs and CD-AuNCs

從圖1中可以看出CD和AuNCs分別在450和580 nm有發射峰， CD和AuNCs混合后的CD-AuNCs保持了CD和AuNCs各自原有的發射峰位置，但AuNCs在580 nm處發射峰有部分重疊，所以發射峰有所變寬。在紫外燈的照射下CD、AuNC以及CD-AuNC分別呈現亮藍色(a)、棕黃色(b)和紫紅色(c)。3個月后再次測試CD-AuNCs，發現其熒光強度無明顯變化，說明CD-AuNCs有良好的穩定性，可長期使用。

2.2 CD-AuNCs的形貌表征

用透射電子顯微鏡對CD-AuNCs的形貌和尺寸進行了表征，結果如圖2所示。圖2中可清晰地看到CD和AuNCs粒子尺寸均接近2 nm，呈球狀，且分散均勻，與文獻報道一致[17-18]。

在370 nm激發波長下得到CD、AuNCs和CD-AuNCs的熒光譜圖和紫外燈下光學照片如圖1所示。

圖2 CD-AuNCs的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of CD-AuNCs

2.3 pH值對CD-AuNCs熒光強度的影響

碳點的合成采用水熱合成法[17]。主要過程為：取2.0 g PEI和4.2 g三乙胺溶解于15 mL三氯甲烷。在冰浴條件下，邊攪拌邊滴加3.8 g乙酸酐，然后氮氣保護下繼續攪拌8 h，得到改性聚乙烯亞胺。取0.2 g改性聚乙烯亞胺和0.2 g檸檬酸溶于5 mL蒸餾水，超聲至改性聚乙烯亞胺完全溶解，然后將溶液轉入到聚四氟乙烯內襯的高壓反應釜中，在180 ℃的烘箱中加熱3 h。取出后用0.22 μm水膜過濾，所得濾液在8 000 r/min的條件下離心10 min，得到純化的棕黑色碳點原液，低溫避光保存備用。

圖3 pH值對CD-AuNCs熒光強度的影響Fig.3 Effect of pH on the fluorescence intensity of CD-AuNCs

2.4 CD-AuNCs對TCs的響應性

隨著儲藏時間的增加，β-半乳糖苷酶的活力不斷降低，這是因為各發酵乳中乳糖經過β-半乳糖苷酶的分解產生的乳酸，抑制了β-半乳糖苷酶的活性，說明β-半乳糖苷酶活力高的菌株能產生更多的乳酸[26]。β-半乳糖苷酶活性的高低都可能有效緩解乳糖不耐癥，但β-半乳糖苷酶的酶活力并不是越高越好，因為有研究表明β-半乳糖苷酶與酸奶的后酸化有關[27]。

圖4 不同TC濃度下的CD-AuNCs熒光光譜圖和FCD/FAuNCs與TC濃度的線性關系Fig.4 Fluorescence spectra of CD-AuNCs with various TC and relationship between FCD/FAuNCs and TC

實驗考察了5種四環素類藥物[四環素(TC)、金霉素(CTE)、地美霉素(DEM)、多西霉素(DOX)、土霉素(OXY)]對CD-AuNCs熒光強度的影響情況。實驗發現這5種四環素類藥物均對CD-AuNCs熒光有猝滅作用，且相同濃度的各種四環素藥物對CD-AuNCs熒光強度的猝滅趨勢和程度基本一致(圖5)，表明可以使用CD-AuNCs檢測TCs總量。

圖5 同樣濃度的各種四環素藥物對CD-AuNCs熒光強度的影響Fig.5 Effect of the same concentration of various tetracyclines on the fluorescence of CD-AuNCs

用單一CD檢測TC結果如圖6所示。當TC濃度在4.4×10-3～4.4×10-2g/L時，CD的熒光猝滅程度(F0-F)/F0和TC濃度存在線性關系，其線性方程為(F0-F)/F0=0.15967+15.55546c，R=0.97。所以說，與單一CD的測試結果相比，CD-AuNCs檢測線性范圍更寬，靈敏度更高。

控制變量。包括企業規模、資產收益率、資產負債率、產權性質、上市時間，并進一步控制了年份和行業影響。控制變量的選取參照了Aihua-Wu等 （2016）；郭曉丹等 （2011） 的研究。

圖6 單一CD在不同TC濃度下的熒光光譜圖和CD的(F0-F)/F0與TC濃度的線性關系Fig.6 Fluorescence spectra of CD with various TC and relationship between (F0-F)/F0of CD and TC

2.5 CD-AuNCs對TC的選擇性考察

考察了CD-AuNCs對非四環素類藥物紅霉素(ERY)、鏈霉素(STR)、氯霉素(CL)、青霉素(PEN)、頭孢曲松鈉(CRO)和磺胺甲基嘧啶(SUL)的響應情況，結果如圖7所示。實驗結果發現：只有四環素類藥物可以猝滅CD-AuNCs的熒光，而其它非四環素類藥物對CD-AuNCs的熒光強度幾乎沒有影響。

圖7 TC和其它非四環素類藥物對CD-AuNCs熒光強度的影響Fig.7 Effects of TC and other non-tetracyclines on the fluorescence of CD-AuNCs

圖8 TC的紫外吸收光譜和CD-AuNCs的熒光激發光譜Fig.8 UV absorption spectrum of TC and excitation spectrum of CD-AuNCs

因為TC的紫外吸收帶和CD-AuNCs的熒光激發帶在370 nm處存在重疊(圖8)，所以我們推測可能是因為內過濾效應的存在，導致TC吸收部分激發光使CD-AuNCs的熒光減弱。又因為內過濾效應和吸收激發光物質的濃度有關，所以隨著TC濃度的增大，CD-AuNCs體系的熒光強度逐漸降低[4,20]。因此，我們可以利用CD-AuNCs實現對四環素類藥物的選擇性檢測。

高內在動機通過增強認知的靈活性和復雜性提升一般創造力。較強的自我實現需要、濃厚的興趣、強烈的使命感和責任感可以激發內在動機，一旦內在動機得到激活，人的一般創造力就會大幅度提升。樹立遠大的理想、信念，培植強烈的社會責任感和使命感，同時保有對某一事物的持久興趣可以激發較高的內在動機。當人感覺到對工作能夠自主支配和有能力時，內在動機最容易產生[8]。給予個體更多的工作自主支配權以及提高個體能力能夠促進提高內在動機。最后，由于外在動機對內在動機存在擠出效應[9]，因而，在可能的情境下，可以盡量減少對個體的經濟報酬、物質獎勵等的外在動機激勵。

3 結論

設計了一種CD與AuNCs結合的雙發射熒光探針，考察了CD-AuNCs的熒光性質、穩定性以及對TCs的傳感情況。研究結果表明CD-AuNCs對四環素類藥物(TCs)響應靈敏且具有選擇性，比單一CD探針具有更寬的線性范圍和更高的靈敏度。