黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對痤瘡致病菌的抑菌實驗研究*

張 怡，趙 鑫，周夢楠，商利娜，趙海寧，王亞靜

（1.天津中醫藥大學現代中藥發現與制劑技術教育部工程研究中心，天津 301617；2.天津中醫藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津 301617）

痤瘡是一種臨床常見的慢性毛囊皮脂腺炎癥性皮膚病，是全球第二大皮膚病[1]。它通常發生在面部，頸部、前胸后背等皮脂豐富的部位，臨床表現多為粉刺、丘疹和膿包，嚴重時伴有結節、囊腫及疤痕等，對患者的身心健康產生嚴重影響[2]。痤瘡的發病機制比較復雜，除與雄激素分泌過多，皮脂分泌旺盛，毛囊角化過度等因素有關外，還與痤瘡致病菌的增殖密切相關[3]。病原學研究表明痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌是痤瘡的主要致病菌[4]，痤瘡丙酸桿菌能夠促進皮脂分泌[5-6]，其代謝產物不僅可以加重毛囊皮脂腺導管增生[7]，還能刺激不同的炎癥調控因子誘發局部炎癥[8-9]；金黃色葡萄球菌可引起局部化膿感染，能夠在痤瘡病灶上加重感染發炎[10]，因此，抑制痤瘡致病菌的增殖對有效治療痤瘡尤為重要。目前臨床上常口服或局部使用抗生素類藥物治療痤瘡，但細菌耐藥性、治療周期長、不良反應等問題也日趨嚴重[11]。

鋅是生理學上重要的微量元素，參與機體各種生物過程，具有一定的抑菌活性[12]，研究表明補充葡萄糖酸鋅能夠有效治療痤瘡[13-14]。青春期機體由于生長發育的需要常伴有鋅的相對不足，低濃度的鋅對維持細胞正常功能是必需的，但高水平鋅的應用會引發細菌耐藥性及機體毒性反應[15-16]。黃芩為常用的清熱解毒類中藥，研究顯示[17]，其醇提物有一定的抑菌活性，在痤瘡治療上具有較大的開發潛力。臨床上中西藥聯合應用較為廣泛，中藥和化學藥聯合應用可取長補短從而有利于疾病治療、減少細菌耐藥性、降低毒副作用[18]。本文以痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌為試驗菌株，考察黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對痤瘡主要致病菌的抑菌活性，現報道如下。

1 主要試劑與儀器

痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，P.acnes，BNCC 336649）購自北納創聯生物技術有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus，ATCC 25923）購自廣東省微生物菌種保藏中心；黃芩片（批號190102）購自河北安國市譽林藥業有限公司；葡萄糖酸鋅（純度99%批號20170412）購自河南雅輝化工產品有限公司；硫酸慶大霉素注射液（批號20170710）購自天津金耀藥業有限公司；頭孢氨芐（批號170301）購自天津市中央藥業有限公司；LB肉湯購自北京索萊寶科技有限公司；改良GAM培養基、營養瓊脂培養基均購自山東拓普生物工程有限公司；厭氧產氣袋、厭氧培養袋（日本三菱瓦斯化學株式會社）；HCB-900V垂直層流潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）；生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；ZWY-240恒溫培養振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器（上海醫用核子儀器廠）；infinite200全波長酶標儀（美國帝肯TECAN公司）。

2 方法

2.1 培養基制備 分別配制硫乙醇酸鹽培養基、改良GAM培養基、LB肉湯和營養瓊脂培養基，將配制好的培養基置錐形瓶中密封，放入滅菌鍋中于121℃下滅菌30 min，待冷卻后，置于4℃冰箱中保存備用。

2.2 菌懸液制備 取100 μL金黃色葡萄球菌甘油凍存液于10 mL LB肉湯中，在37℃、150 r/min的條件下置于恒溫振蕩器中培養16 h進行活化，隨后采用平板計數法進行菌落計數，使用前用LB肉湯稀釋；取100 μL痤瘡丙酸桿菌甘油凍存液于5 mL硫乙醇酸鹽培養基中，在37℃條件下厭氧培養48 h進行活化，隨后采用平板計數法進行菌落計數，使用前用改良GAM肉湯稀釋。

2.3 供試藥液制備 參考文獻[19]稱取定量黃芩于燒杯中，加10倍量60%乙醇于60℃條件下提取兩次，每次1 h，趁熱抽濾后合并濾液，回收溶劑至0.5 g/mL（以生藥計算），存放于4℃備用；稱取葡萄糖酸鋅0.5 g定容至10 mL，即得濃度為50 mg/mL的葡萄糖酸鋅溶液。

2.4 藥物抑菌活性考察 采用牛津杯法測定藥物的抑菌圈直徑來考察藥物的抑菌活性。在無菌條件下，取 100 μL 金黃色葡萄球菌菌懸液（1×105CFU/mL）于營養瓊脂培養基上均勻涂布，每板放5枚牛津杯，于孔內分別加入黃芩、葡萄糖酸鋅以及兩種藥物等體積混合均勻的藥液各100 μL，陽性對照為硫酸慶大霉素溶液（0.4 mg/mL）20 μL，陰性對照為無菌水100 μL，將平板放于37℃生化培養箱中培養24 h。

取100μL痤瘡丙酸桿菌菌懸液（1×106CFU/mL）于改良GAM培養基上均勻涂布，每板放5枚牛津杯，于孔內分別加入黃芩、葡萄糖酸鋅以及兩種藥物等體積混合均勻的藥液各100 μL，陽性對照為頭孢氨芐溶液（0.1 mg/mL）50 μL，陰性對照為無菌水100 μL。將平板與厭氧產氣袋一同放入厭氧培養袋中，在37℃生化培養箱中培養48 h。

結果采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，實驗平行測定3次。

2.5 藥物最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定 采用微量2倍稀釋法測定藥物的MIC和MBC，考察黃芩、葡萄糖酸鋅對金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌的體外抑菌效果。首先對藥物進行2倍稀釋，稀釋后黃芩提取液濃度為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 mg/mL；葡萄 糖 酸 鋅 溶 液 濃 度 為 50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 mg/mL。于 96 孔細菌培養板內分別加入各濃度藥液100μL，再加入菌懸液100 μL，同時設置陽性對照（空白菌液），陰性對照（空白藥液）和培養基對照，孔內終體積不足200 μL用相應肉湯補齊，培養條件同2.4項，測定A值，測量前用槍頭反復吸打混勻，以抑制率≥80%的藥物濃度為其MIC[20]。取≥MIC濃度的孔內培養液100 μL于平板上涂布，按照相應條件繼續培養，取菌落數≤5個的藥物濃度為其MBC，實驗平行測定3次。

抑制率計算公式：

2.6 聯合用藥抑菌活性測定 采用棋盤法評價黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對痤瘡致病菌的體外聯合抑菌效果。設置孔內藥物終濃度為2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，分別沿著無菌的96孔細菌培養板的橫軸、縱軸添加不同濃度的兩種藥物各50μL，再加入菌懸液100 μL，同時設置陽性對照（空白菌液），陰性對照（空白藥液）和培養基對照，孔內終體積不足200 μL用相應肉湯補齊，培養條件同2.4項，采用測定MIC的方法對聯合用藥時細菌的生長情況進行檢測，實驗平行測定3次。并計算FICI[21]，判斷聯合用藥效果，計算方法為：FICI=MICA藥聯用/MICA藥單用+MICB藥聯用/MICB藥單用

當FICI≤0.5時，為協同作用；當0.5＜FICI≤0.75時，為部分協同作用；當0.75＜FICI≤2時，為無關作用；當FICI＞2時，為拮抗作用。

2.7 時間-生長曲線 以棋盤法試驗結果為依據，進一步考察黃芩與葡萄糖酸鋅較優組合下的聯合抑菌效果，于孔板內分別加入含有黃芩和葡萄糖酸鋅的混合藥液以及聯合作用時兩藥各自濃度下的藥液，培養及測量條件同2.5項，金黃色葡萄球菌每隔2 h測定一次A值，痤瘡丙酸桿菌分別于0、2、4、6、8、10、24、36、48 h 測定 A 值，以時間為橫坐標，活菌率為縱坐標繪制時間-生長曲線。

活菌率計算公式：

2.8 數據統計分析 數據使用SPSS 22.0和Origin 8.5.1軟件進行分析和繪圖，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間差異顯著性判斷采用方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 黃芩和葡萄糖酸鋅單用及聯用時的抑菌活性結果 通過牛津杯法考察藥物的抑菌活性，結果見表1。黃芩與葡萄糖酸鋅聯用后對金黃色葡萄球菌的抑菌活性與黃芩單用相比顯著增強（P＜0.01），而與葡萄糖酸鋅單用相比無明顯差異（P＞0.05）；聯合用藥對痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性與兩藥單獨使用相比均顯著增強（P＜0.01）。

表1 黃芩、葡萄糖酸鋅單用及聯用對痤瘡致病菌的抑菌活性結果（±s） mm

表1 黃芩、葡萄糖酸鋅單用及聯用對痤瘡致病菌的抑菌活性結果（±s） mm

注：與陰性對照比較，**P＜0.01。

抑菌物質 抑菌圈直徑金黃色葡萄球菌 痤瘡丙酸桿菌陽性對照 24.10±0.67** 36.69±0.01**陰性對照 0 0黃芩 12.24±0.52** 8.98±0.45**葡萄糖酸鋅 19.21±0.57** 10.70±0.71**聯合用藥 19.34±0.48** 15.46±0.08**

3.2 黃芩和葡萄糖酸鋅單用時的MIC和MBC結果 通過微量二倍稀釋法和菌落計數法考察黃芩與葡萄糖酸鋅的MIC和MBC，結果見表2。

表2 黃芩和葡萄糖酸鋅對痤瘡致病菌的MIC和MBC結果 mg/mL

3.3 聯合抑菌作用

3.3.1 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對金黃色葡萄球菌的抑制作用 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對金黃色葡萄球菌的抑菌活性測定結果如圖1所示，生長率＞20%標記為黑色，生長率≤20%標記為灰色，結果顯示，在1/4 MIC黃芩-1/2 MIC葡萄糖酸鋅作用下，聯合用藥開始表現明顯的抑菌作用。

圖1 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對金黃色葡萄球菌的抑菌作用結果示意圖

基于黃芩和葡萄糖酸鋅聯合應用時的最低抑菌濃度計算相應的FICI，并對兩者聯合作用進行評價。由表3中FICI可知，黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對金黃色葡萄球菌的抑制具有部分協同作用。

表3 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

3.3.2 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性測定結果如圖2所示，生長率＞20%標記為黑色，生長率≤20%標記為灰色，結果顯示在1/8 MIC黃芩-1/8 MIC葡萄糖酸鋅、1/4 MIC黃芩-1/8 MIC葡萄糖酸鋅、1/8 MIC黃芩-1/4 MIC葡萄糖酸鋅、1/4 MIC黃芩-1/4 MIC葡萄糖酸鋅作用下，聯合用藥開始表現明顯的抑菌作用。

圖2 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對痤瘡丙酸桿菌的抑菌作用結果示意圖

基于黃芩和葡萄糖酸鋅聯合應用時的最低抑菌濃度計算相應的FICI，并對兩者聯合作用進行評價。由表4中FICI可知，黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對痤瘡丙酸桿菌的抑制具有協同作用。

表4 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對痤瘡丙酸桿菌的抑菌作用

3.4 時間-生長曲線 基于棋盤法測得的聯合用藥時的最低抑菌濃度繪制時間-生長曲線，由圖3可知，與細菌正常生長和同濃度下藥物單用組相比，聯合用藥作用下金黃色葡萄球菌的生長更為緩慢，遲緩期的持續時間更長，明顯抑制了細菌進入對數生長期的進程，且在對數生長期活性低，持續時間短，最高活菌率僅為20%。作用20 h后，聯合用藥組活菌率開始減少，進入衰亡期，而陽性對照組細菌處于穩定期，單獨用藥組的活菌率仍呈上升趨勢。綜上所述，黃芩與葡萄糖酸鋅聯用對金黃色葡萄球菌抑制作用更強。

圖3 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用下金黃色葡萄球菌的時間-生長曲線

由圖4可知，1/8 MIC濃度黃芩對痤瘡丙酸桿菌無抑菌活性，1/8 MIC濃度葡萄糖酸鋅與細菌作用24 h后活菌率高達70%，但當1/8 MIC濃度黃芩與1/8 MIC濃度葡萄糖酸鋅聯用時，細菌在48 h內均處于遲緩期，表明聯合用藥完全抑制了痤瘡丙酸桿菌的生長，抑菌強度和速度遠高于同濃度下的任一藥物，兩者聯用具有顯著協同抑菌作用。

4 討論

圖4 黃芩與葡萄糖酸鋅聯用下痤瘡丙酸桿菌的時間-生長曲線

在青春期，雄性激素水平升高導致皮脂分泌增加和痤瘡丙酸桿菌的高度定植，痤瘡丙酸桿菌數量的增加是痤瘡病理生理學的重要因素[22]。痤瘡丙酸桿菌可直接刺激皮脂腺和角質形成細胞[23]，并通過分泌各種蛋白質包括裂解性外酶和趨化因子誘發和維持局部炎癥[24]。除痤瘡丙酸桿菌外，金黃色葡萄球菌在痤瘡病灶上加重感染發炎，是炎癥過程的間接貢獻者[10]。

本實驗以痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌為實驗菌株考察黃芩和葡萄糖酸鋅的聯合抑菌效果，研究顯示，兩者聯用對痤瘡致病菌的抑菌活性顯著增強，MIC均下降，對金黃色葡萄球菌的FICI為0.75，表現為部分協同作用，對痤瘡丙酸桿菌的FICI為0.25，表現為協同作用。聯合用藥降低了兩者單用時的藥物濃度，有助于提高用藥的安全性，對臨床治療痤瘡具有重要的現實意義和經濟意義。

黃芩及其有效成分作為天然產物，其抑菌機制通常是通過影響細菌細胞膜的形成及通透性，干擾菌體內蛋白質合成，抑制細菌代謝和DNA拓撲異構酶等多條途徑[25-26]。鋅主要通過破壞細菌細胞膜導致細胞內容物的溶出，從而使細菌喪失生物學活性，其作用機制較為單一，長期或過量使用會引發毒性和細菌耐藥性[27]。兩者聯用的增效機制可能是兩種藥物各自抑菌機制的結合，也有可能與黃芩所含有效成分與葡萄糖酸鋅生成的配合物抑菌效果更強有關[28]。有關聯合用藥的抑菌機理、增效機制以及是否對其他致病環節有調控作用等還需繼續深入探討和研究。