重黃溫敏凝膠中重樓皂苷Ⅵ含量測(cè)定及體外釋放研究*

孫 媛，丁江生，萬近福

（云南省藥物研究所，昆明 650111；2.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650111）

重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-M.azz.或七葉一枝 花 Paris polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根莖，性涼，味苦，微寒，有小毒，歸肝經(jīng)。具有清熱解毒、消炎消腫、涼肝熄風(fēng)、利膽退黃、除風(fēng)定痙、止血止痛、攻堅(jiān)化積、截瘧等功效?？裳a(bǔ)水、氣、血，通氣血。現(xiàn)代藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤、止血止痛、抗病毒，抑菌消炎和免疫調(diào)節(jié)及肝臟保護(hù)等作用?，F(xiàn)已分離并鑒定出50余種化合物，主要為皂苷類成分，約占化合物總含量的80%。重樓皂苷具有抗腫瘤、清熱解毒、消炎止痛、止血等功效，是云南白藥、宮血寧等中成藥的主要成分之一[1-6]。

重樓皂苷主要活性成分是甾體皂苷及苷元，其中又分為薯蕷皂苷類化合物和偏諾皂苷類化合物?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定了薯蕷皂苷類化合物重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ和偏諾皂苷類化合物重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ作為衡量重樓植物藥用價(jià)值的指標(biāo)。近年來的研究進(jìn)一步表明偏諾類皂苷在藥理活性上更具優(yōu)勢(shì)，特別是其中的重樓皂苷Ⅵ有止血、祛痰、抑菌、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗早孕殺滅精子、抗腫細(xì)胞等作用，臨床用于治療功能性子宮出血等。因此，采用主要含偏諾類皂苷的重樓提取物進(jìn)行組方，制備重黃溫敏凝膠。同時(shí)，鑒于偏諾皂苷類化合物的4個(gè)主要指標(biāo)成分中重樓皂苷Ⅵ含量最低，也最易被干擾出現(xiàn)檢測(cè)誤差而影響重黃溫敏凝膠的質(zhì)量判斷。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇重樓皂苷Ⅵ作為檢測(cè)指標(biāo)，采用高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）對(duì)重黃溫敏凝膠的質(zhì)量情況和體外溶蝕釋放情況進(jìn)行考察，為該藥制劑成型和體內(nèi)釋藥研究提供理論依據(jù)[7-10]。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫）；2000ES ELSD檢測(cè)器（美國奧泰公司）；XWK-Ⅲ型空氣發(fā)生器（天津市津分分析儀器制造有限公司）；ZRS—8G智能溶出實(shí)驗(yàn)儀（天津大學(xué)無線電廠）；THZ-82恒溫振蕩器 （金壇市富華儀器有限公司）；ETS--4fuzzy磁力攪拌器（德國 IKA）；AR2130型電子天平（美國Capintec公司）；Delta320 PH計(jì)（梅特勒托利多）；KH3200E黏度測(cè)定儀（昆山禾創(chuàng)超聲有限公司）；KH3200E超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲有限公司）；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療）。

1.2 試劑和藥品 重樓皂苷Ⅵ對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)111592-201203）；重黃溫敏凝膠（自制）；泊洛沙姆 407（Poloxamer 407，德國 BASF公司）；泊洛沙姆 188（Poloxamer 188，德國 BASF 公司）；丙二醇（國藥試劑集團(tuán)）；乙腈（色譜純，默克股份）；超純水；其他試劑為分析醇。

2 方法與結(jié)果

2.1 重黃溫敏凝膠的制備 精密稱取處方量的重樓等提取物，加入丙二醇分散，再在連續(xù)攪拌下依次加入水、苯扎溴銨和泊洛沙姆407、泊洛沙姆188，攪拌直至完全溶解，加水定重，放置4℃冷藏24 h，即得。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 CAPCELL PAK C8色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，資生堂），乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～15 min，25%～35%A；15～35 min，35%～40%A；35～40 min，40%～60%A），柱溫 25℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，漂移管溫度92℃，載氣流速2.9 L/min，增益2，撞擊器關(guān)。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取重樓皂苷Ⅵ對(duì)照品21.5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，超聲（150 W，40 kHz）5 min，搖勻，即得。

2.2.3 樣品溶液制備 精密稱取2.0 g重黃溫敏凝膠，置于10 mL容量瓶中，加甲醇8mL，超聲20 min，放冷，甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別將重樓皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液、樣品溶液、空白溶液以及樣品加對(duì)照品溶液按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。此條件下重樓皂苷Ⅵ分離良好，無干擾。見圖1。

2.2.5 線性關(guān)系和定量限考察 分別精密量取2.2.2項(xiàng)下重樓皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積的常數(shù)對(duì)數(shù)值（lgA）對(duì)濃度的常數(shù)對(duì)數(shù)值（lgC）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：lgA=1.796 9 lgC+4.398 9（r2=0.999 9），0.430 0～4.300 0 mg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。以信噪比（S/N）約為10的重樓皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液為定量限：0.054 0 mg。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)HPLC圖

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.5項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算重樓皂苷Ⅵ的峰面積的RSD為1.51%（n=6），表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算重樓皂苷Ⅵ的峰面積的RSD為3.08%（n=6），表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取2.0 g重黃溫敏凝膠6份，按2.2.3項(xiàng)下要求，配制樣品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算重樓皂苷Ⅵ的含量，RSD為2.70%（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的重黃溫敏凝膠，分別按含量的50%、100%、150%精密加入重樓皂苷Ⅵ對(duì)照品，按2.2.3項(xiàng)制備樣品溶液，每個(gè)濃度平行制備3份，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=9）

2.2.10 含量測(cè)定 分別精密稱取3批重黃溫敏凝膠，按2.2.3項(xiàng)制備樣品溶液，每個(gè)樣品平行制備2份，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，為標(biāo)示量的90%～110%。見表2。

2.3 膠凝時(shí)間測(cè)定 采用試管倒置法來判斷凝膠的相變溫度：平行稱取6份重黃溫敏凝膠于試管中，將試管置于水浴中緩慢升溫，于分別于（31.0±0.1）℃、（32.0±0.1）℃、（35.0±0.1）℃、（37.0±0.1）℃、（39.0±0.1）℃、（41.0±0.1）℃、（43.0±0.1）℃和（45.0±0.1）℃測(cè)定膠凝時(shí)間，每間隔30 s傾斜一次試管，直至凝固，記錄時(shí)間。見圖2。

表2 重樓皂苷VI含量測(cè)定結(jié)果表

圖2 膠凝曲線圖（n=6）

證明此溫敏凝膠從（35.0±0.1）℃起，膠凝時(shí)間明顯加快，在體溫時(shí)（37±0.1）℃僅需（2.90±0.58）min即可成膠。

2.4 體外釋放考察 取25 mL具塞試管，精密稱取5.0 g重黃溫敏凝膠于試管內(nèi)，置于（37±0.1）℃恒溫水浴振蕩器中，待完全凝膠后，緩緩加入已脫氣的pH4.0的磷酸鹽緩沖液5.0 mL，平行制備6份樣品，放入（37.0±0.1）℃恒溫水浴振蕩器中，振蕩頻率為120 r/min，于 0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、30、36、48 h取樣，取出全部溶蝕介質(zhì)，稱重后將試管放回恒溫水浴振蕩器中膠凝，緩慢補(bǔ)加相同溫度的空白溶蝕介質(zhì)5.0 mL，重復(fù)操作，直至剩余凝膠質(zhì)量不足初始重量的10%。相鄰時(shí)間點(diǎn)間質(zhì)量差異即為重黃溫敏凝膠溶蝕量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣后，按相應(yīng)比例加入甲醇稀釋至規(guī)定體積，0.45 μm微孔濾膜過濾，采用上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算重樓皂苷Ⅵ的累積釋放量。并對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的藥物累積釋放率進(jìn)行探討。見表3和圖3。

表3 重黃溫敏凝膠溶蝕釋放擬合表

圖3 重黃溫敏凝膠pH4.0緩沖液中溶蝕釋放情況

結(jié)果顯示，重黃溫敏凝膠溶蝕量和重樓皂苷Ⅵ體外釋放均符合Higuchi方程，12 h釋放67.63%，24 h釋放85.65%。表明重黃溫敏凝膠在人體陰道微環(huán)境中釋藥，基質(zhì)溶蝕是限速條件。

3 討論

2015 版《中華人民共和國藥典》重樓項(xiàng)下的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，重黃溫敏凝膠在該波長(zhǎng)下測(cè)定時(shí)重樓皂苷Ⅵ干擾明顯，無法達(dá)到預(yù)期檢測(cè)效果。本研究采用HPLC-ELSD檢測(cè)，不僅藥典項(xiàng)下的4種重樓皂苷實(shí)現(xiàn)良好的分離檢測(cè)，還將偏諾重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷PA和重樓皂苷H進(jìn)行了較好的分離，為進(jìn)一步研究重樓偏諾皂苷提供了技術(shù)支持。

重黃溫敏凝膠的體外溶蝕釋放符合Higuchi方程，且在12 h釋放可達(dá)67.63%，不僅滿足用藥需求，還能減少藥物給藥次數(shù)，保證藥效的同時(shí)，增加患者的用藥順應(yīng)性，為重黃溫敏凝膠制劑推廣提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)藥物從重黃溫敏凝膠制劑中釋放的情況進(jìn)行了研究，對(duì)于釋放后在人體陰道中的吸收利用情況還需進(jìn)一步探討。

重黃溫敏凝膠需在體內(nèi)以半固體形態(tài)存在，且隨著處方中黏性物質(zhì)比例的增加，凝膠強(qiáng)度進(jìn)一步加大，藥物釋放較低溫時(shí)的液體形態(tài)發(fā)生明顯改變。因此，體外溶蝕釋放研究對(duì)藥物的利用和療效有指導(dǎo)意義。